细胞分裂素调控大孢子母细胞发生的分子机理研究

Specification of megaspore mother cell (MMC) is the foundation for female gametogenesis in angiosperms, and is the prerequisite for alternation of generations as well as reproduction. Our previous works showed that mutations in type-B ARRs ARRa, ARRb and ARRc, components of cytokinin signaling pathway, led to the formation of 2-3 enlarged cell phenotypic MMC in the ovule primordia. These MMC-like cells can develop into embryonic sacs and form 2-3 embryos within one ovule. qRT-PCR studies revealed that a number of regulatory genes participating in MMC specification were decreased in arr a b c triple mutant. These results suggest that ARRa, ARRb and ARRc were involved in MMC specification. In this proposal, we intend to investigate the functions of ARRa, ARRb and ARRc in regulating MMC specification. The results may facilitate our understanding on mechanisms of cytokinin signaling-mediated MMC specification.

被子植物的大孢子母细胞是雌配子体形成的基础，是完成世代交替和繁殖后代的前提。我们的前期研究发现，细胞分裂素信号转导途径中B类ARR家族中的ARRa/b/c突变造成单个胚珠中有2-3个细胞体积增大且表现出大孢子母细胞的形态特征；这些细胞可以发育形成多个胚囊，并通过受精过程最终产生2-3个胚。qRT-PCR分析显示前人报道的多个参与大孢子母细胞发生调控的基因转录水平在arrs突变体中呈现下调。这些结果说明ARRa/b/c参与了大孢子母细胞发生的调控。本申请拟在前期工作的基础上，深入分析ARRa/b/c作用的下游基因，构建大孢子母细胞发生的分子调控网络，为理解细胞分裂素调控大孢子母细胞发生的分子机理提供新信息。

大孢子母细胞是雌配子体形成的基础，是完成世代交替和繁殖后代的前提。细胞分裂素调控植物生长发育多个方面，其生物学功能通过信号转导途径中的B类响应调节因子（Arabidopsis Response Regulators，ARR）介导下游基因转录实现。B类ARRs的11个成员中，ARR1、ARR10和ARR12发挥主要作用。前人研究发现细胞分裂素参与雌配子体发育过程，然而其调控大孢子母细胞发生的机理尚不清楚。本研究对ARR1、ARR10和ARR12调控雌配子体发育，特别是大孢子母细胞发生的分子机理开展研究。结果发现，处在3-Ⅵ 时期的arr1/10/12三突变体胚珠中，有24.78%仅有1个细胞核，无法完成受精；36.64%存在多于8个细胞核，多出的细胞具有反足细胞、中央细胞和卵细胞等细胞性质；4.25%的胚珠中有2个卵细胞完成受精并分别发育成胚，说明ARR1/10/12参与了雌配子体发育调控。利用pARR1::ARR1-3GFP、pARR10::ARR10-3GFP和pARR12::ARR12-3GFP报告株系观察，发现ARR1/10/12在珠心L1层细胞和大孢子母细胞周围的细胞中表达。arr1/10/12 处在2-Ⅱ时期的胚珠中，20.74%出现多于1个具有大孢子母细胞特征的现象，说明ARR1/10/12调控大孢子母细胞的形成。arr1/10/12三突变体中WRKY28的表达下调。遗传学分析发现，ARR1/10/12作用于WRKY28的上游。特异地在WRKY28表达区域降低ARR1/10/12转录，能够造成与arr1/10/12三突变体类似的大孢子母细胞增多的表型，说明对WRKY28的转录调控是ARR1/10/12调控大孢子母细胞发生的关键环节。ChIP-qPCR和EMSA分析发现，ARR1/10/12可以直接结合到WRKY28基因的启动子区域。在WRKY28表达区域增强ARR1/10/12转录造成大孢子母细胞数量增多。BiFC和Pull-down实验证明ARR1/10/12与WRKY28存在互作。提示ARR1/10/12与WRKY28互作调控WRKY28转录，进而调节大孢子母发生。上述结果揭示了ARR1/10/12通过与WRKY28的互作调节WRKY28转录，从而调控大孢子母细胞的形成，为理解细胞分裂素调控大孢子母细胞发生的机理提供了新信息。