鞘氨醇杆菌咔唑上游降解途径操纵子及调控机制研究

Carbazole is a representative nitro-containing contaminant in fossil fuels. Microbial organisms mainly degrade carbazole through angular dioxygenation pathway. The scholars have carried out the a large number of metabolic pathways and genetic researches on the carbazole degradation, but there has been few information on the studies of the molecular regulation mechanism. Sphingobium yanoikuyae XLDN2-5 can use carbazole as the sole carbon and nitrogen source. The upstream carbazole degradation genes of XLDN2-5 are distributed in two gene cluster, consisting of two regulatory genes and ten structural genes, and resulting in multiple operons. This project will use XLDN2-5 as the object to determine the operon promoter location and regulation of protein binding region by primer extension, Gel mobility shift and DNase I footprinting technique. To investigate the interactions between substrate, regulation proteins and operator genes by using Gel mobility shift and circular dichroism spectrometer. The results of this project will establish a new pattern of carbazole metabolic regulation, and lay the foundation for metabolic regulatory study of Sphingobium.

咔唑是化石燃料中一种有代表性的含氮污染物，微生物主要通过有角度双加氧途径降解咔唑。学者们已开展了大量的代谢途径和基因方面的研究，但对涉及到微生物代谢咔唑的分子调控方面的研究却很少。Sphingobium yanoikuyae XLDN2-5是课题组保存的一株咔唑高效降解菌株，前期研究表明该菌中咔唑降解上游基因分布在两个基因簇上，由两个调节基因和十个结构基因组成，构成多操纵子。本项目将以该菌为研究对象，通过引物延伸、凝胶阻滞和DNA酶I足迹等技术确定各操纵子启动子位置和调节蛋白的结合区域；利用凝胶阻滞和圆二色谱等手段研究底物、调节蛋白和操纵基因的相互作用，阐明咔唑代谢相关的调节基因的生物学功能。本申请的研究结果将揭示一种新的咔唑代谢调控模式，为全面揭示鞘氨醇杆菌咔唑分解代谢的调控机制打下基础。

通过申请者前期的研究结果和跟踪国际上关于咔唑代谢机制研究进展发现：XLDN2-5中咔唑代谢基因簇结构与以往报道的存在较大差异。该菌株中存在多个与咔唑代谢有关的操纵子，其结构模型与已报道的假单胞菌的不相同，是一种新型的咔唑操纵子模型。本申请以XLDN2-5为研究对象，揭示其咔唑上游代谢调节基因的生物学功能和调控模式。. 项目研究工作基本严格按照研究计划开展，通过对基因组的分析确定了XLDN2-5咔唑代谢基因簇的操纵子结构，以及操纵子的调控区域序列和功能区域；克隆并纯化了各个调控蛋白，通过体外的凝胶阻滞实验验证了咔唑代谢的调控位点，阐明了调控蛋白与各个启动子的相互作用模式；并构建了CRISPRi的基因关闭系统，关闭调控蛋白的表达，以从体内证实各个调控蛋白的生物学功能；通过蛋白质组学并结合RT-qPCR验证的手段，从宏观上证明咔唑不仅可以激活其相关降解基因簇的表达，还可以激活细菌多个代谢系统的工作，加速菌株的生长，阐明的菌株代谢咔唑的调控模式。所开展的研究工作较好的完成了项目任务，揭示了菌株的咔唑代谢操纵子的结构和调控模式，为阐明该属微生物代谢的分子调控机制提供了数据参考，为将来的环境领域和工业领域的大规模应用打下基础，相关论文正在整理投稿中。