sRNA在鞘氨醇单胞菌TY降解尼古丁中的调控功能研究

Microbial bioremediation is the main way to relieve the nicotine residue in environment. As the most important regulatory elements found in many bacteria, sRNAs paly important role in physiology activities and gained growing attention in recent years. Many researches about sRNA have been focused on the pathogenesis of pathogenic bacteria or stress response of several type strains, little attention has been paid to pollutant degradation and regulation of pollutant degradation under adversity. Sphingomonas melonis TY was an effective nicotine-degrading strain. Besides, the pathway and the molecular mechanism of nicotine degradation in strain TY have been fully studied by our research group. Based on the previous study, we will use the data analysis of sRNA RNA-seq to predict putative nicotine degradation- and nicotine degradation under cold stress- related sRNA first, then by using RT-qPCR, Northern blot, gene knockout and gene complementation to identity the role of these predicted sRNA, and using the EMSA, activity of infusions, point mutation and secondary structure of RNA to clarify the regulatory function of sRNA in nicotine degradation. Our research will help to understand the function of sRNA in pollutant degradation and their regulatory role in pollutant degradation to resist stress. In addition, this study will provide important guidance to the bioreactor, soil bioremediation, and waste water treatment, especially to the low activity under cold environment.

微生物降解是去除环境中尼古丁的主要途径。sRNA作为广泛存在于细菌内且对基因表达起重要调控作用的调控元件获得了越来越多的关注。目前sRNA研究主要在致病菌致病机制和模式菌株压力应答方面，sRNA调控污染物降解及胁迫条件下污染物降解的研究还十分缺乏。鞘氨醇单胞菌TY可高效降解尼古丁，课题组前期对其降解分子机制进行了深入研究。本研究拟以菌株TY为研究对象，在前期基础上，利用RNA-seq和生物信息分析等技术预测与尼古丁降解及低温胁迫下尼古丁降解相关的sRNA，通过RT-qPCR、Northern blot、基因敲除、基因回补与过表达等技术鉴定其功能，进一步利用EMSA、融合子活性检测、点突变及RNA二级结构鉴定等手段阐明sRNA调控尼古丁降解的机制。本研究有助于深入了解在污染物降解过程中以及低温情况下sRNA的调控情况，对于微生物在生物反应器、土壤强化修复及污水处理中的低温瓶颈有重要意义。

尼古丁是一种典型含氮杂环污染物。微生物修复是去除环境中尼古丁经济有效的方法。目前已阐明几株代表菌株中尼古丁降解途径和分子机制，而对于尼古丁代谢调控作用的研究还较少，只在Pseudomonas putida S16中发现了一个nic2的调控蛋白NicR2，以及Shinella sp. HZN7菌株中可能与尼古丁降解相关的调控基因ORFW13-1和ORFW13-2。sRNA是广泛存在于细菌内且对基因表达具有重要调控作用的调控元件，目前仍缺乏对微生物中sRNA调控各类污染物降解的研究。.本项目主要研究内容为sRNA在鞘氨醇单胞菌TY降解尼古丁中的调控功能。我们以鞘氨醇单胞菌TY为研究对象，在前期对TY菌株尼古丁降解途径与机制及sRNA RNA-seq基础上，利用数据分析和生物信息学等技术预测与尼古丁降解相关sRNA，首先通过RT-qPCR检测了候选sRNA的表达情况，建立适用于sRNA的Northern blot技术用于进一步检测sRNA在菌内的表达。随后，我们通过cDNA末端快速克隆技术获得sRNA SNC137、sRNA-B、sRNA-C和sRNA-E等的全长信息。分别构建多个sRNA突变株及相应回补株，对其进行表型分析。结果表明多个sRNA与尼古丁降解、碳源利用、生物膜形成、抗氧化胁迫相关。后期研究中，主要针对sRNA SNC137进行了功能研究，通过基因敲除回补、靶基因筛选、报告基因表达等技术初步探究了sRNA SNC137在TY菌株在氨基酸合成、质膜形成、级联调控等基本代谢过程及尼古丁降解中的调控作用。我们发现与尼古丁转运相关的基因ndpT、尼古丁降解第一步尼古丁脱氢酶编码基因ndpA及第二步6-羟基-L-尼古丁氧化酶编码基因ndpB的表达量都显著降低。说明sRNA SNC137缺失后对尼古丁上游代谢相关基因的表达产生显著影响，这可能是突变株TYSNC137不能利用尼古丁的关键原因。此外，我们对sRNA SNC137的二级结构及伴侣蛋白也进行了初步分析，仍需进一步探究。.本项目初次对sRNA在菌株TY降解尼古丁中的功能进行了探究，发现多个sRNA可能影响尼古丁的降解，重点探究了sRNA SNC137对尼古丁代谢的调控机制。同时还发现TY菌株中的sRNA参与多个生理过程的调控。本项目为尼古丁代谢的基础研究做出了贡献，并探索出sRNA与污染物代谢调控的新课题。