SIRT1介导光动力治疗肺癌细胞凋亡的分子调控机制研究

The main approach of photodynamic therapy (PDT) is based on tumor cells apoptosis induced by reactive oxygen species (ROS). Studies showed that the activation of SIRT1 is dependent on the high levels of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) induced by ROS,indicating that SIRT1 is involved in PDT, but the molecular mechanism hasn’t been reported. Our previous study confirmed that Bim serve a major role in PDT-induced lung cancer cells apoptosis. Moreover,our preliminary experimental results showed that the PDT lead to high expression of SIRT1 and its substrate FOXO3a nuclear localization increase. Thus we speculated that SIRT1/FOXO3a/Bim pathway play an important role in PDT-induced apoptosis. To verify the hypothesis, on the basis of previous studies, by using NAD+ analysis and fluorescence resonance energy transfer(FRET) etc, revealing the precise molecular regulation mechanism between SIRT1 and FOXO3a/Bim during Photofrin- and 5-amino ketones pentanoic acid-PDT induced lung cancer cells apoptosis. Further study the role of SIRT1 in tumor inhibition by tumor nude mice model. Then confrim the mechanism of PDT for lung caner by analysis of clinical samples. This study will not only reveal the molecular mechanism of SIRT1 in PDT, but also to provide a new thinking for the development of lung cancer treated with PDT.

光动力治疗（PDT）肿瘤的主要途径是通过活性氧诱导细胞凋亡。研究表明，活性氧可上调烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）激活去乙酰化酶SIRT1，提示SIRT1参与PDT，但其分子机制尚未见报道。课题组前期研究证实Bim在PDT诱导肺癌凋亡中至关重要，且预实验结果发现PDT涉及SIRT1表达及其底物FOXO3a细胞核定位增加，提示PDT通过激活SIRT1/FOXO3a/Bim通路诱导细胞凋亡。为了验证该假设，本项目将在前期研究基础上，采用NAD+分析和荧光共振能量转移等手段，在分子水平探索光卟啉-和艾拉-PDT诱导肺癌细胞凋亡中SIRT1与FOXO3a/Bim之间的分子调控机理；再通过皮下成瘤裸鼠模型，研究SIRT1在PDT中抑制肿瘤生长的作用；再结合临床样本进一步明确SIRT1介导PDT治疗肺癌的主要机制。本研究不仅可以揭示SIRT1介导PDT的分子调控机制，更为发展肺癌PDT方案提供新思路。

报道显示，2020年中国肺癌死亡人数高达71万，占死亡总数23.8%，成为危害健康的最大天敌之一。探索肺癌治疗策略具有重大的医学和社会意义，是提高居民健康的迫切需求。近年来，以多学科交叉手段研发新型联合治疗方案为肺腺癌患者提供了希望。我们主要研究PDT诱导细胞凋亡的作用与分子机制，并探索潜在基因联合治疗方案。研究发现PDT处理后胞内NAD含量迅速上升，同时活化SIRT1，促进FOXO3a因子从细胞质转移至细胞核，诱导肿瘤细胞凋亡。Znln2S4-PDT可以引起明显的细胞凋亡现象，在Znln2S4-PDT处理后，胞内ROS水平和细胞凋亡率均显著增加，Bax、caspase-3和caspase-9的表达也升高。此外，Znln2S4-PDT不仅能促进A549的凋亡，还可以显著促进CIB1基因敲除细胞的死亡率及Caspase-8/-1的活化，证实了Znln2S4-PDT与靶向CIB1分子的基因治疗联合可有效促进肺腺癌疗效。我们分离了中国型HSV-1-LXMW溶瘤病毒株，并对其进行鉴定、测序及详尽的结构与生物学功能分析，初步构建基于HSV-1-LXMW载体的CIB1基因敲除质粒，为进一步开展联合治疗提供重要支持。同时基于TCGA数据库分析明确肺腺癌样本中CIB1的mRNA和蛋白质水平相比对照组显著升高。我们进一步构建CIB1过表达及基因敲除细胞系，并分析肺腺癌临床标本发现与正常癌旁肺部组织相比，CIB1分子在肺腺癌中显著高表达。此外Znln2S4-PDT处理的CIB1基因敲除细胞系的死亡水平以及Caspase-1/8的活性水平均明显升高。这些研究表明CIB1基因干扰可能触发肿瘤细胞焦亡来提高PDT疗效，为进一步探索其分子调控机制及开发CIB1基因干扰与PDT的联合治疗奠定了坚实的基础。