DDW诱导非小细胞肺癌细胞凋亡及其分子机制的研究

Deuerium(D) is a isotope of hydrogen (H), D and H form heavy water. Scientists determined the content of D in natural water and continental organisms is 150ppm. D plays important roles in the bodies of organisms, but this has been neglected for a long time. D affects mitosis, DNA repair enzymes and genetic factors, and hence leads to tumor. Studies have proved that deuterium depleted water (DDW) can inhibit cancer cell growth and induce apoptosis. The exact molecular mechanisms of DDW have not been elucidated..Our group found that DDW can induce apoptosis in non-small cell lung cancer (NSCLC), gene expression microarray screening retrieved 7 apoptosis-related genes upregulated by DDW, this has laid the foundation toward clarifying the underlying molecular mechanisms. This study aim to identify crucial molecules involved in DDW-induced apoptosis. Functional studies on these genes and proteins will be very useful in assigning apoptotic pathways. All these work will provide theoretical evidences for further application of DDW in clinical NSCLC treatment.

氘（D）是氢(H)的同位素，氘与氧结合生成重水(D2O)。经科学家测试，氘在自然界水和陆地生物体内的含量约为150ppm。氘在生物体内具有重要的生物学作用，长期以来被人们忽视。氘能影响生物体有丝分裂，损伤DNA修复酶，影响遗传因子机能，引起恶性肿瘤。已有研究表明，低氘水（氘含量低于150ppm，简称DDW）在体、内外均可抑制肿瘤细胞的生长并诱导癌细胞凋亡，而DDW上述生物学作用的分子机制目前尚不清楚。.本课题组前期研究发现DDW可以诱发非小细胞肺癌细胞凋亡，通过裸鼠移植瘤基因表达谱芯片筛选到7个与凋亡密切相关的重要基因，这为从分子水平上阐明DDW引发凋亡的分子机理提供了重要线索。本课题拟进一步通过差异表达基因和蛋白质的筛选寻找相关信号通路中的关键分子，并在此基础上进行蛋白质的功能研究，进而确定DDW诱导肺癌细胞凋亡的信号通路，从而为DDW在肿瘤临床治疗中的应用提供理论依据。

氘在生物体内具有重要的生物学作用。氘能影响生物体有丝分裂，损伤DNA修复酶，影响遗传因子机能，引起恶性肿瘤。已有研究表明，低氘水（DDW）在体、内外均可抑制肿瘤细胞的生长并诱导癌细胞凋亡，而DDW上述生物学作用的分子机制目前尚不清楚。本课题主要研究内容包括：1、研究低氘水对人肺腺癌细胞A549增殖和细胞周期的影响； 2、研究低氘水对A549裸鼠皮下移植瘤和原位移植瘤生长的影响；3、应用转录组测序技术（RNA-seq）检测低氘水对A549细胞基因表达的影响；4、应用高通量磷酸化抗体芯片筛选DDW引起的信号通路关键分子变化，并用Western Blot进行验证；5、DDW诱导A549细胞分化以及机理的研究；6、基于气质联用开展荷瘤裸鼠血清代谢组学研究。研究结果如下：低氘水处理后人肺腺癌细胞A549生长受到抑制，且细胞周期变化明显。低氘水组裸鼠皮下移植瘤生长缓慢。原位移植瘤实验结果表明，对照组肺组织上产生多个瘤体，分布密集，而低氘水组裸鼠肺组织上仅有少数瘤体，肺组织形状保持相对正常。肺组织HE染色表明，低氘水组肺组织中的肿瘤病灶明显比对照组小。 通过转录组测序（RNA-seq）技术找到与增殖密切相关的差异表达基因有KRT18、ANGPTL、 FTH1、EGFR、GREM1、CAV1等；与凋亡密切相关的差异表达基因有BAX、CDKN1A、 IER3、PEA15、DNAJB9、EGFR等。通过GO-BP聚类分析，发现并集差异表达基因可信度最高的功能聚类为血管生成（p=2.8×10-12），其中包括ITGAV、COL4A2、ID1、ANGPTL4、SERPINE、EPHA2等差异表达基因。 磷酸化抗体芯片实验结果显示低氘水通过抑制与细胞增殖和分化有关的MAPK/ERK信号通路而抑制细胞的增殖，并且DDW对A549细胞的生长抑制作用与MEK1的磷酸化水平降低有关。 DDW长期培养诱导A549细胞由II型肺泡上皮向I型肺泡上皮的转化。DDW可显著上调水通道蛋白AQP5和T1a两种I型肺泡上皮特异性标志物的表达，同时SPC1和SPC2两种II型上皮特异性表面活性蛋白的表达也显著提高（P＜0.01)。基于气质联用的代谢组学方法研究表明，饮用普通水和低氘水的移植瘤裸鼠产生的代谢物差异与糖类代谢密切相关。结论：以上研究结果初步阐明了DDW抑制肺癌细胞增殖的分子机