在斑马鱼胚胎上建立基因打靶技术的研究

斑马鱼是一种广泛应用于发育、遗传及疾病模型创建等研究领域的重要模式动物。新近建立的锌指核酸酶（ZFN）技术虽可定向突变特定基因，但还不能在指定的基因座上精确地进行点突变、缺失、插入及条件性敲除等改造，因此在斑马鱼上建立基因打靶技术十分必要。基因打靶是一项利用同源重组原理定向改造内源基因的遗传学技术，依赖于动物胚胎干细胞系的建立。由于在斑马鱼上一直无法建立胚胎干细胞系，本研究将直接以斑马鱼胚胎细胞为操作对象。已知ZFN对基因组的切割可导致切割点附件的同源重组效率提高多个数量级，因此本申请将重点开展在斑马鱼胚胎上建立基于ZFN协助的基因打靶技术的研究，实现在斑马鱼特定基因上进行点突变、缺失、插入及条件性敲除等改造。此外，我们还将对在斑马鱼胚胎上建立不依赖于ZFN的基因打靶技术进行探索性研究，以绕开ZFN技术瓶颈。实现我们的预期研究目标，将会为利用斑马鱼开展的相关研究提供强有力的技术手段。

项目的背景. 斑马鱼是一种广泛应用于发育、遗传及疾病模型创建等研究领域的重要模式动物。人工核酸酶技术虽可靶向突变斑马鱼基因，但还不能像传统的基因打靶技术一样对目标基因精确地进行点突变、缺失、插入及条件性敲除等改造，本研究的目标在于在斑马鱼上建立基因打靶技术。.主要研究内容. 在斑马鱼胚胎上开展建立基于EEN协助的基因打靶技术的研究，实现在斑马鱼特定基因上进行点突变、缺失、插入及条件性敲除等改造。.重要结果、关键数据及其科学意义等. 将以eGFP、ntl和c-myca为模式分子的同源受体、同源供体和制造DSB的ZFN同时注射入斑马鱼受精卵，结果发现外源的同源供体和受体可在胚胎细胞内实现同源重组，重组率达1%。但如果以内源性基因为受体，同源重组率小于0.1%。进一步地，敲降斑马鱼ku70、p53、ku70 + p53、过表达rad51、提供单链供体、降低环境温度、添加秋水仙素、和提高供体浓度均不能提高外源供体和受体在胚胎细胞中的同源重组率。. 运用TALEN技术，制作了黄颡鱼mstnb和斑马鱼foxc1a基因敲除突变体；分析不同切割效率TALEN对诱导斑马鱼foxc1a位点同源重组的影响，发现同源重组率可达1%，但更多的突变等位基因表现为在插入的供体同源臂的两侧添加有非特异DNA序列。利用这一策略，成功地在foxc1a基因位点敲入可表达Foxc1a-P2A-YFP融合蛋白的foxc1a等位基因的斑马鱼基因敲入突变体胚胎。. 利用CRISPR/Cas9技术，创建了46个基因敲除斑马鱼突变体；发明了一种可显著提高斑马鱼基因组编辑效率的方法，将筛选基因组改造突变体的时间从剪取初建者的尾鳍进行基因型鉴定提前到直接在荧光显微镜下筛选仍为胚胎的初建者。利用这种策略，分别获得了在aldh1a2基因第3或第4内含子中插入mloxp的斑马鱼基因敲入突变体。运用在内含子3中插入mloxp的纯合子的第4内含子中再次敲入mloxP位点的策略，获得了aldh1a2基因第3和第4内含子同时敲入了mloxp的斑马鱼胚胎，注射Cre mRNA后，目标基因片段被成功敲除。我们在aldh1a2基因位点上建立的这种条件性敲除斑马鱼突变体的技术体系，为大规模制备条件性敲除斑马鱼突变体奠定了基础。