KZFP在斑马鱼胚胎发育中的作用及其机制研究

经典Wnt信号是调控早期胚胎发育中的重要信号通路。然而，目前对wnt基因本身的表达调控还不甚了解。我们在前期研究中鉴定到一个母系来源的转录因子，KZFP,可以调控wnt8a的表达。实验证明：抑制KZFP导致原肠运动障碍及背部化，过表达KZFP则诱导无眼畸形；这些表型同wnt8a诱导的表型近似，提示二者相关。其次，抑制KZFP导致wnt8a表达的显著下调，而过表达KZFP可以诱导wnt8a的异位表达。再者，我们鉴定了KZFP的DNA结合位点，并发现wnt8a启动子中包含3个KZFP位点，启动子分析实验也表明KZFP促进wnt8a启动子的活性。本申请拟在上述基础上，系统阐明KZFP调控胚胎发育的具体过程，鉴定KZFP的生化特性，研究KZFP介导的转录调控过程的具体机制以及KZFP与其它调控wnt8a表达的信号通路之间的相互关系，以期深入揭示KZFP在早期胚胎发育中调节细胞分化和运动的分子机制。

本项目围绕一个新的Wnt信号调控因子开展。Wnt通路是调控细胞分化、胚胎发育和肿瘤发生的重要信号通路。目前，对wnt信号分子本身的表达调控还不十分清楚。本项目鉴定到一个新的斑马鱼早期发育过程的必须转录因子KZFP，后改称为KZP，是调控wnt8表达的重要因子。我们系统地研究了敲降KZP在斑马鱼中引起的胚胎发育表型，发现细胞运动和细胞分化出现显著障碍。接着，我们通过基因芯片分析了KZP潜在的下游靶基因，发现包括wnt8在内的许多早期发育重要基因显著下调。在此基础上，我们围绕KZP-wnt8及其下游靶基因的转录调控及生物学作用开展一系列研究。首先，我们证明了了KZP是一个直接结合DNA的转录因子，并且发现其N端的锌指簇是其主要的DNA结合结构域，证明其结合的DNA位点为5' -(T/A/G)T(A/T/G)NCTGCCA-3'。然后，我们重点研究了KZP对wnt8的表达调控作用，证实KZP可以直接结合到wnt8启动子区域调控其合子表达的起始和维持。通过研究KZP与已知调控wnt8 表达的重要信号如fgf8等因子的遗传互作关系，我们发现KZP可能是一个调控wnt8启动子活性的基础转录因子，因为缺失kzp的表达过表达fgf8等信号不能有效地刺激wnt8a的表达。其次，我们还深入研究了KZP其他潜在的发育生物学作用。利用gata1，flk1，insulin，lysc等转基因品系系统分析kzp的发育生物学表型，我们发现kzp 对造血系统的正常发育是至关重要的， KZP 能够特异地调控gata1、gata2、scl 等基因的表达从而控制造血系统的细胞分化，进一步的分析表明，gata1 、gata2和pu.1基因启动子中均含有KZP 的保守结合位点，通染色质免疫共沉淀实验我们证明kzp可以结合到这些基因的启动子区。最后，因为在人的KZP同源基因与肿瘤发生高度相关，我们还深入挖掘kzp调控的下游靶基因，重点集中在ENC1、eif3i等一些可能与肿瘤和细胞分化相关基因。总之，通过本项目的实施，我们初步探究了的KZP的基本生物学功能，揭示了KZP对wnt8等重要信号分子的表达调控作用，为进一步理解以KZP为节点的调控网络在细胞分化、胚胎发育和肿瘤发生中的作用奠定基础。