Dnmt3和Dnmt5调控不同倍性鱼性腺发育的表观遗传学机制研究

Ecological risk problem has become the bottleneck which restricts the promotion of fine aquiculture varieties. Developing a strategy of controlling the fertility via studying the regulatory mechanism on reproduction in fish can solve this problem effectively. We have obtained the fertile allotetraploid crucian carp via distant hybridization, and then produced the sterile triploid crucian carp by interploid hybridization. Previous studies demonstrated that the sterile triploid crucian carp displayed abnormal hormone secretion and disordered chromosome synapsis in meiosis, and thus could not produce germ cells with reproductive effec. DNA methylation is an important epigenetic modification. In this study, we choose the fertile and sterile polyploid fish as the material. Firstly, we need to clear the association between DNA methyltransferase and fertility of different ploid fish via comparative analyzing both mRNA and protein expression patterns of Dnmt3 and Dnmt5 during the gonad development process. And then, combined the gene knockout to study the interactions of DNA methytransferases with other important reproduction related pathways (e.g. Piwi-piRNA complex and Hypothalamus-Pituitary-Gonadal (HPG) axis). Finally, find out the downstream methylated targets of Dnmt3 and Dnmt5. All these evidences will elucidate the epigenetics mechanism of gonadal development in different ploid fish by Dnmt3 and Dnmt5. This study one side lays a foundation to deep discussion the epigenetics regulating mechanism of reproduction and development in fish, on the other side, provides a new idea and theoretical basis for fish variety improving.

生态风险是制约优良水产养殖品种推广的瓶颈，通过研究鱼类生殖的调控机制寻找到鱼类育性控制的策略则可以有效地解决这一难题。申请者所在的课题组通过远缘杂交得到两性可育的异源四倍体鲫鲤，再通过倍间杂交得到了不育的三倍体鲫鲤。前期的研究表明三倍体鲫鲤内分泌系统紊乱，减数分裂异常，无法形成有生殖效应的配子。DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰。本项目以育性不同的多倍体鱼为材料，拟通过比较分析Dnmt3和Dnmt5的表达特征明确其与不同倍性鱼育性问题的相关性；结合基因敲除的技术研究它们在调控性腺发育的过程中与其它重要生殖相关通路 (Piwi-piRNA复合体和HPG轴) 的相互作用关系；进一步通过MSAP方法寻找下游甲基化靶标，最终阐明Dnmt3和Dnmt5调控不同倍性鱼性腺发育的分子机制。此项研究为深入探讨鱼类生殖发育的表观遗传学调控机制奠定了基础，为鱼类品种改良提供了新的思路和理论依据。

优良的水产养殖品种不仅应具备潜在的巨大经济效益，同时也要有效避免伴随推广带来的潜在生态风险。关于鱼类生殖育性调控的分子机理一直是鱼类遗传育种领域备受关注的科学热点问题。申请人所在课题组通过远缘杂交和倍间杂交的方法以二倍体红鲫和异源四倍体鲫鲤为亲本获得了异源三倍体鲫鲤，并从形态学和细胞遗传学的角度证实了异源三倍体鲫鲤稳定不育的生殖特性。该稳定不育的异源三倍体鲫鲤为研究鱼类的育性调节机制提供了非常好的研究材料。哺乳动物中的研究表明，DNA从头甲基化酶参与建立新的甲基化位点，在生殖细胞的形成与成熟过程中都起着非常重要的作用。为消除染色体倍性对基因表达的影响，本项目的实验设计拟将不育的雌性异源三倍体鲫鲤和可育的雌性二倍体鱼和异源四倍体鱼进行比较研究DNA从头甲基化酶与鱼类生殖育性的相关性及调节机制。按照本项目的计划进行研究发现，首先，通过取卵巢组织利用染色体铺展技术发现，异源三倍体鲫鲤的卵母细胞联会出现障碍，且减数分裂关键基因的表达量变化也证实了这一点。其次，分析dnmt3基因在三种不同倍性鱼的繁殖期和非繁殖期两个时期的表达量发现，dnmt3在异源三倍体鲫鲤卵巢中的表达量均低于二倍体和异源四倍体鱼，但是在精巢中表达量没有变化，证实其与异源三倍体鱼不育的相关性。然后，利用雌二醇、人绒毛膜促性腺激素和DNA甲基化酶抑制剂处理异源三倍体鱼研究雌性激素与DNA甲基化酶之间的相互作用关系，发现雌二醇可通过雌二醇受体诱导dnmt3基因的表达。最后，对dnmt3的下游调控基因进行研究探索，发现当dnmt3基因表达量上升时，会使msh4基因外显子上的DNA甲基化水平升高，从而使msh4基因的表达量下降。本项目的研究结果首次阐明了dnmt3参与调控鱼类生殖育性的分子机制，为深入探讨鱼类生殖发育的表观遗传学调控机制奠定了基础，为鱼类品种改良提供了新的思路和理论依据。