硬骨鱼类性腺分化发育的表观遗传机制研究

目前，有关表观遗传机制调控脊椎动物性腺分化发育的研究非常有限，特别在鱼类，几乎是空白。我们前期研究发现：黄鳝和斑马鱼性腺分化发育相关的重要功能基因性腺芳香化酶（cyp19a1a）和foxl2启动子区域存在较多潜在的CpG甲基化位点，并且黄鳝cyp19a1a基因启动子区域的DNA甲基化水平在性腺由雌性到雄性转变过程中升高，提示表观遗传机制在鱼类性腺分化发育中可能起重要作用。本项目拟分析不同性腺状态下，黄鳝和斑马鱼性腺中cyp19a1a和foxl2基因启动子DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传变化；表观遗传修饰对相关基因表达及其转录因子（FTZ-F1和Sox等）作用的调节；促性腺激素上调cyp19a1a基因表达性别差异的表观遗传调控；以及DNA甲基转移酶基因表达与相关基因启动子DNA甲基化状态的关系等。研究结果对于阐明表观遗传修饰在鱼类以及其它脊椎动物性腺分化发育中的作用和机制有重要意义。

本项目探讨了表观遗传修饰与硬骨鱼类性腺分化的关系。黄鳝性腺中cyp19a1a启动子甲基化水平在性逆转过程中明显提高，启动子上CRE位点从间性开始处于甲基化状态，这可能是促性腺激素可以上调其在卵巢的表达，但对间性性腺和精巢中表达无影响的原因。卵巢中cyp19a1a启动子区域H3K9处于去甲基化状态和乙酰化状态，而在精巢中处于甲基化状态和去乙酰化状态，提示cyp19a1a启动子区域染色质在卵巢中处于转录激活状态，而在精巢中处于转录抑制状态，这与黄鳝性腺中cyp19a1a表达在性逆转中不断下降一致。. 腹腔埋植DNA甲基转移酶抑制剂可以抑制黄鳝自然性逆转过程。低剂量抑制剂腹腔埋植时可明显上调性腺中cyp19a1a表达，降低体外孵育的精巢中cyp19a1a启动子甲基化状态，却提高基因表达水平。上述结果表明，DNA甲基化和组蛋白修饰等可能通过调节性腺中cyp19a1a的表达，参与黄鳝自然性逆转过程的调控。不同物种，特别是硬骨鱼类cyp19a1a启动子区域CpG位点存在较明显的保守性：在Ftz-F1位点附近CpG位点较集中，而且一般含CpG的CRE位点。斑马鱼卵巢中cyp19a1a近端启动子区域甲基化水平明显低于精巢，hCG仅诱导卵巢中cyp19a1a表达，提示表观遗传修饰调控性腺cyp19a1a表达在硬骨鱼类具有保守性。. 黄鳝foxl2基因表达水平在卵巢中高表达，随性逆转过程其表达水平不断下降，提示Foxl2对黄鳝卵巢发育和维持非常重要。黄鳝精巢中foxl2启动子DNA甲基化水平高于卵巢，提示DNA甲基化修饰可能抑制精巢中foxl2基因的表达。. 克隆了黄鳝六种DNA甲基转移酶基因，分别为Dnmt1、2、3a1、3a2、3b1和3b2。除dnmt3b1表达具有较强的组织特异性外，其余5种dnmt在各组织广泛表达。性逆转过程中，黄鳝垂体、下丘脑和性腺中各种dnmt基因表达量都较高，提示DNA甲基化对这些器官功能维持都有较重要的作用。. 黄鳝dnmt3a1 mRNA定位在卵巢卵母细胞质的外周和颗粒细胞，以及早期雄性生殖细胞。免疫组织化学分析表明Dnmt3a1可能在精原细胞表达，Dnmt3b1可能在精巢生殖细胞表达，Cyp19a1a主要在卵母细胞质外周和颗粒细胞表达。