MiRNAs靶向Smoothened逆转弥漫大B细胞淋巴瘤化疗耐受的研究

Chemoresistance is a core challenge in preventing successful treatment and cure of diffuse large B cell lymphoma (DLBCL). We have found that aberrant activation of hedgehog (HH) signaling in diffuse large B cell lymphoma promotes cell proliferation and enhances chemoresistance. Further study shows Smoothened (SMO), HH signaling transducer, can activate both HH and NF-kB signaling pathways that play critical roles in cell survival of DLBCL, suggesting that targeting SMO is of high clinical interest in reversing DLBCL chemoresistance. To further understand SMO-induced chemoresistance and uncover cellular mechanisms that mediate chemoresistance induced by SMO in DLBCL, we propose to screen and identify chemoresistance related miRNA, make miRNA and SMO reporter system, screen and identify miRNAs targeting SMO by Genebank/RNAHybrid software analysis and miRNA mimics/inhibitors assays, analyze the effect of miRNA on SMO mRNA cellular localization and translation by confocal microscopy and [35S] - methionine-labeled assay. Interfering SMO expression by miRNA will represent new therapeutic approaches to increase chemosensitivity for DLBCL.

化疗耐受是影响弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）疗效的核心问题。我们前期研究发现，Hedgehog（HH）信号通路可以促进DLBCL细胞增殖导致化疗耐受，进一步研究发现，Smoothened(SMO)，HH信号传导子，可以同时活化HH和NF-kB两条重要信号存活通路，提示靶向SMO对DLBCL的化疗耐受具有重要治疗价值。本项目拟通过miRNA芯片及QRT-PCR筛选和鉴定化疗耐受相关miRNA，构建miRNA和SMO报告系统，采用Genebank及RNAHybrid 软件分析和miRNA增强或抑制试验筛选和鉴定调控SMO的miRNA，通过共聚焦显微镜和[35S]蛋氨酸掺入等方法分析miRNA对SMO mRNA胞内定位和翻译的影响，旨在获得miRNA调控SMO逆转DLBCL化疗耐受的证据，阐明miRNA调控SMO的具体分子机制，为逆转DLBCL化疗耐受提供新疗法。

肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6），在许多生物过程中起着至关重要的作用，包括肿瘤的发生、发展、转移及放化疗耐受。其生物学活性相关的多种肿瘤包括弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。SMO是卷曲类G蛋白偶联受体（GPCRs）家族的重要成员，是经典Hedgehog信号通路中的重要信号转导分子。我们通过体外研究发现，Smoothened（SMO）可通过募集TRAF6至细胞膜，抑制TRAF6泛素化，降低TRAF6的降解进而稳定TRAF6的表达，而TRAF6在DLBCL中可放大pAkt信号通路，进而介导了DLBCL的化疗耐药。此外，免疫组化及QRT-PCR显示DLBCL肿瘤组织中SM0 与TRAF6的表达成正相关，且SMO高表达均提示患者预后差，进一步体外细胞凋亡实验发现，敲除SMO可增加DLBCL对化疗药物阿霉素的敏感性。进一步证实SMO可介导DLBCL化疗耐受，提示靶向SMO有可能逆转DLBCL化疗耐受。微小RNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，最近的研究发现，miRNA表达与多种肿瘤相关，可通过靶向癌基因抑制肿瘤化疗耐受。我们的研究发现，小剂量化疗药阿霉素可诱导DLBCL细胞中SMO的表达，而进一步miRNA芯片及QRT-PCR发现miR-30c-1-3p小剂量doxorubicin处理后DLBCL细胞中表达下调。通过targetscan及RNaHybrid软件比对，发现miR-30c-1-3p可能直接靶向SMO 3’-UTR。进一步体外实验发现，miR-30c-1-3p可直接靶向SMO并抑制SMO基因及蛋白表达。此外DLBCL肿瘤组织QRT-PCR显示SMO与miR-30c-1-3p表达成负相关。总之，我们的研究揭示了一个全新的重要的细胞生存信号通路，miR-30c-1-3p/SMO / TRAF6 / Akt信号通路，靶向该信号通路可有效逆转DLBCL化疗耐受。