寻常型天疱疮发病机制中沉默胆碱能受体亚型对角质形成细胞棘层松解影响的研究

Pemphigus vulgaris is an autoimmune dermatosis characterized by autoantibody in the patient sesum. Previous research revealed cholinergic receptor pathway play some role in the pathogenesis of pemphigus vulgaris except the desmoglein pathway. While the exact mechanism is unclear. In this research,α9 and m3 AChR, which have more close relationship with adhesion function, are chosen as research object. The expression of the two AChR subtypes will be respectively interference in keratinocyte, then the α9 and m3 AChR silenced keratinocyte will be co-cultured with pemphigus vulgaris immunoglobulin G (PV-IgG). The cells model of pemphigus vulgaris established by wild type keratinocyte and PV-IgG will be used as control. We will detect the degree of acantholysis and shrinkage of cytoskeleton, so as to analysis α9 and m3 play whether a promoter or an inhibitor in the pathogenesis of pemphigus vulgaris. We will detect the expression of desmolglein1, desmoglein3 and plakoglobin in protein and mRNA level, as well as the distribution of these molecules. The phosphorylation of key signal molecules during the acantholysis process such as p38 MAPK and EGFR will be also detected. This research will improve the theory of pathogenesis in pemphigus vulgaris and provide a basis for exploring the new therapeutic target for pemphigus vulgaris.

寻常型天疱疮是一种由自身抗体介导的免疫性皮肤病，前期研究提示除桥粒芯蛋白途径外，胆碱能受体途径在该病的发病中也发挥一定作用，但其机制尚不明确。本研究中我们选择α9和m3 AChR这两种与粘附功能关系较为密切的胆碱能受体亚型作为研究对象；在体外培养的角质形成细胞中分别干扰这两种受体的表达，然后用PV-IgG刺激，以野生型角质形成细胞与PV-IgG构建的天疱疮细胞模型作为参照，对比棘层松解的严重程度和细胞骨架的收缩情况，从而分析α9和m3 AChR在棘层松解过程中对细胞粘附起到保护作用还是对棘层松解起着“推波助澜”的作用；同时检测这一过程中细胞表面关键粘附分子Dsg1、Dsg3以及PG在蛋白水平和mRNA水平的表达情况以及在细胞表面的分布变化；检测棘层松解关键信号分子p38 MAPK和EGFR的变化情况，从而进一步完善寻常型天疱疮的发病机制理论，乃至为探索并发掘新的天疱疮治疗靶点提供理论基础。

寻常型天疱疮是一种由自身抗体介导的自身免疫性皮肤病，除桥粒芯蛋白途径外，胆碱能受体途径在该病的发病中也发挥一定作用。本研究中我们选择α9和m3 AChR这两种与粘附功能关系较为密切的胆碱能受体亚型作为研究对象，探索胆碱能受体途径在天疱疮发病中的作用。首先利用HaCaT细胞和PV-IgG构建了天疱疮的细胞模型，我们观察到桥粒分子出现了与体内棘层松解过程一致的变化。然后我们直接干扰m3和α9 AChR这两种表皮蛋白的表达，发现干扰m3 AChR的表达后，HaCaT细胞的粘附力下降，桥粒稳定性下降；干扰α9 AChR并不影响细胞粘附功能，但可使桥粒稳定性上升。在天疱疮的细胞模型中，在m3 AChR干扰时，HaCaT在PV-IgG作用下更容易发生棘层松解，骨架相关的Dsg3和PG明显下降，且EGFR的活化程度增强，而α9 AChR干扰对棘层松解有保护作用，在PV-IgG作用下，桥粒分子不发生内化，骨架相关Dsg3和PG不减少，Dsg3与PG的相互作用更紧密，p38 MAPK和EGFR均不发生磷酸化。m3和α9 AChR在天疱疮的发病中发挥一定作用，且二者在棘层松解某些环节上的作用是相反的。我们应用间接免疫荧光的方法，比较正常人皮肤、猴食管及盐裂正常人皮肤三种不同底物检测自身免疫性表皮内水疱病循环抗体的沉积情况及其敏感性和特异性差异。对于天疱疮，猴食管和盐裂正常人皮肤为底物间接免疫荧光敏感性均高于以正常人皮肤为底物间接免疫荧光，而猴食管与盐裂正常人皮肤间接免疫荧光间敏感性无显著性差异，因此，在猴食管不易取得时，可使用盐裂间接免疫荧光替代正常人皮肤间接免疫荧光。且猴食管为底物间接免疫荧光对于存在Dsg3抗体的患者敏感性高于仅有Dsg1抗体的患者。猴食管、盐裂正常人皮肤间接免疫荧光的结果与Dsg1 ELISA指数水平无关。血清学研究中，我们研究了Dsg1与Dsg3的ELISA值和天疱疮患者临床表型、疾病活动度关系及变化规律，结果表明Dsg抗体谱与天疱疮临床表型相关，其ELISA值可用于监测疾病活动，并可对治疗的有效性作出评价。