系统分析NAD对氧化还原信号传导和新陈代谢的影响

NAD and NADP are the most important biomolecules and play important roles in almost all biological processes. Systematic and quantitative analysis of regulation and functions of NAD is the research frontier in NAD field. The work proposed herein is to apply a systematic approach with protoemics, metabolomics, biochemistry and molecular biology to study the NAD mediated redox signal transduction and metabolic pathways, and the crosstalk among these pathways.The completion of the proposed work will shed light on systematic understanding of NAD functions. The methods established in the present work for characterization of redox proteome and acetylome, and analysis metabolite flux analysis are useful toold for studying other biological systems.

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ）及其磷酸化形式（ＮＡＤＰ）在几乎所有的生理过程中都发挥着重要作用。系统、定量地分析ＮＡＤ的调控和功能是目前ＮＡＤ研究的前沿。大量研究表明NADP调控着细胞内还原型谷胱甘肽的水平，而NAD可以通过去乙酰化酶Sirtuins调控细胞的新陈代谢。本项目将在这些工作和我们前期工作的基础上，通过NAD水解酶CD38的过表达及沉默来调控NAD在细胞中浓度；并应用和发展蛋白质修饰组学和生物化学的方法，系统地研究在不同NAD浓度的细胞中，蛋白质乙酰化的状态和氧化过激对细胞内蛋白质半胱氨酸残基氧化的影响。我们还将使用代谢流量分析研究NAD对能量代谢和线粒体功能的影响，从而能够更深入地理解NAD对代谢途径和氧化还原信号途径的调控，并且力求寻找这些通路之间的对话机制。这些研究将让我们从系统和量化的角度理解ＮＡＤ的功能，建立更全面的ＮＡＤ调控的信号网络。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤ）及其磷酸化形式（ＮＡＤＰ）在衰老和疾病等生理过程中发挥重要的作用。本项目拟达到两个主要目标：分别研究NAD和细胞的氧化还原态，氧化还原信号传导，以及代谢通路之间的关系，并且从理论上揭示NAD的功能，以理解NAD对整个系统的作用机制。具体研究内容包括：（1）用基因调控和化学调控的方法改变NAD在细胞在中的浓度；（2）用氧化还原蛋白质组学的方法研究受NAD调控的氧化还原信号传导和细胞的氧化还原态的变化；（3）用乙酰化组学分析发现受NAD调控的Sirtuins的底物蛋白并用代谢组学方法分析研究NAD对细胞新陈代谢通路的影响。.在本项研究中，我们构建了过表达胞内CD38蛋白的稳转细胞株。发现N端切除的CD38蛋白的过表达使得细胞内NAD的含量降低35%左右。CD38过表达的细胞株不仅生长速率降低，而且对氧化应激敏感。定量蛋白质组学的研究结果发现，在CD38过表达的细胞中有178种蛋白的表达出现了下调；抗氧化蛋白和DNA修复相关蛋白的下调是导致细胞对氧化应激更加敏感的原因。.我们比较了NAD降低对不同细胞的影响。NAD降低上调A549细胞中NAMPT的水平。代谢组学分析发现NAD的降低导致糖酵解通路的代谢产物显著降低，证明NAD调控细胞的新陈代谢通路。本项研究有两个重要的发现：1）NAD的降低通过增加活性氧分子导致抑癌因子15-PGDH的降解，从而引起细胞发生上皮-间质细胞转换（EMT）； 2）NAD的下调激活多个调控EMT的信号通路，特别是IL6, TGF-beta和STAT3相关的通路，为发现衰老和肿瘤发生发展的关系奠定了基础。.我们建立了乙酰化组学的方法研究NAD依赖的去乙酰化酶，发现SIRT3的过表达导致蛋白合成速度的下调，为SIRT3作为抑癌基因提供了新的证据。我们研究了分枝杆菌中SIR2的功能。发现过表达SIR2导致分枝杆菌的耐药性增加，并鉴定出四十多个SIR2的底物和去乙酰化位点。.总之，本项研究建立了调控NAD水平的细胞模型和多个组学方法，发现NAD降低引起细胞类型特异的变化， 建立了NAD水平和新陈代谢、氧化应激以及EMT之间的关系，为研究NAD和衰老相关疾病的关系奠定了基础。