TET2基因截短突变在一代EGFR TKIs获得性耐药中的作用及相关机制研究

Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor（EGFR-TKI）for the treatment of non-small cell lung cancer（NSCLC）with EGFR mutation stands out as one of the notable landmarks in precise treatment，however，drug resistance is still a bottleneck of long-term survival. To explore resistant mechanism and new methods for reversing drug resistance is of great importance. In our previous research, we have discovered a possible new mechanism of resistance for the first-generation EGFR-TKIs based on next generation sequencing (NGS)：TET2 mutation. Our further cell experiments demonstrated that，knock down of TET2 gene decreased the sensitivity of PC-9 to gefitinib；and increased the methylation levels of EGFR gene promoter. Based on our previous results，in this research we will study the sensitivity of different PC-9 cells to gefitinib after silencing or introduction of TET2 gene in order to clarify the role of TET2 mutation in the acquired resistance to the first-generation EGFR TKI；and we will use the MeDIP-seq techonology to explore the molecular mechanism of TET2 mutation leading to acquired resistance to the first-generation EGFR TKI. The study is expected to provide new ideas and potential targets for the treatment of patients with secondary resistance to the first-generation EGFR-TKIs.

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）应用于EGFR基因突变非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌精准治疗的里程碑，但耐药仍是影响患者长期生存的瓶颈，探索耐药机制、寻找逆转耐药的新方法具有重要意义。我们基于二代测序技术研究发现一代EGFR-TKIs获得性耐药可能的新机制：TET2基因截短突变。进一步细胞实验证实，TET2基因功能下调可以导致一代EGFR-TKI药物吉非替尼的敏感性降低；并且可以导致EGFR启动子基因甲基化水平升高。在此基础上，本课题拟研究TET2基因沉默或导入后，不同PC-9细胞株对一代EGFR TKI敏感性的变化，阐明TET2基因截短突变在一代EGFR TKIs获得性耐药中的作用；并采用MeDIP-seq技术，探索TET2基因突变导致吉非替尼获得性耐药的相关分子机制。本项目的开展有望为EGFR-TKIs获得性耐药患者治疗提供新思路及潜在靶点。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）应用于EGFR基因突变非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌精准治疗的里程碑，但耐药仍是影响患者长期生存的瓶颈，探索耐药机制、寻找逆转耐药的新方法具有重要意义。项目负责人前期基于二代测序技术研究发现一代EGFR-TKIs获得性耐药可能的新机制：TET2基因突变；进一步细胞实验证实，TET2基因功能下调可以导致一代EGFR-TKI药物吉非替尼的敏感性降低。在此基础上，本课题拟研究TET2基因沉默或导入后，不同PC-9细胞株对一代EGFR TKI敏感性的变化，阐明TET2基因截短突变在一代EGFR TKIs获得性耐药中的作用；并采用MeDIP-seq技术，探索TET2基因突变导致吉非替尼获得性耐药的相关分子机制。 本项目重要结果及关键数据如下：（1）成功构建并鉴定TET2干扰/过表达PC-9/H1650细胞株；（2）细胞实验证实，TET2 敲减可减弱吉非替尼诱导的EGFR敏感突变肺腺癌细胞株PC9 细胞及H1650细胞的凋亡；TET2 敲减可减弱EGFR敏感突变肺腺癌细胞株PC9 细胞及H1650细胞对吉非替尼的敏感性；TET2 敲减的PC9 细胞及H1650细胞EGFR信号通路相关蛋白磷酸化发生在吉非替尼高浓度处理组；（3）采用简化甲基化测序技术检测TET2敲减PC9细胞株及对照PC9细胞株的基因甲基化谱差异。最终，我们选出了10个候选基因进行进一步验证：AXIN2, PIDD1, NR4A1, CSK, SHC1, GHR, SOX17, POU4F2, SPI1, WNT4；（4）我们进一步采用Real-time PCR方法对TET2敲减PC9细胞株及对照PC9细胞株中上述10个候选基因的表达水平进行验证。结果显示，除了POU4F2基因之外，其余9个基因在实验组细胞株中表达均低于对照组。其中，AXIN2与CSK两个基因的表达水平在实验组与对照组细胞株中具有显著差异。上述结果提示，TET2基因突变导致的TET2表达下降可能通过诱导AXIN2或CSK甲基化水平升高（表达水平下降）进而导致一代EGFR TKI耐药的发生。（5）细胞实验证实去甲基化药物地西他滨处理可以增强PC9及H1650细胞对吉非替尼的敏感性。本项目的开展有望为EGFR TKIs获得性耐药患者治疗提供新思路及潜在靶点。