FGF-2信号通路介导EGFR-TKIs快速获得性耐药的分子机制研究

Recent evidence indicated that FGF-2 pathway, as a tyrosine kinases receptor signaling transduction pathway, may be involved in "rapidly acquired resistance to target therapy" in NSCLC cell lines within 1 to 2 days. We investigated the effect of EGFR-TKI on two NSCLC cell lines, and the result revealed the blockage of EGFR as well as the up-regulations of FGFR2 protein and mRNA. Thus, it seems that FGF-2 singaling might be activated by EGFR-TKI in a certain types of NSCLC cell lines, however, the mechanism of FGF-2 in mediating drug-resistance is almost unknown and needs a further elucidation. We plan to continue the investigation by inducing the rapidly acquired resistance to EGFR-TKI in NSCLC cell lines, and evaluate the resistance status using indexes such as cell proliferation, cell apoptosis, cell invasion and resistance-associated molecular mutations. The downstream signal molecules are to be investigated by aRNA array so that key molecules could be detected. Thus, the study will unveil the molecular mechanism of FGF-2 signaling in mediating rapidly acquired resistance to EGFR-TKI, and supply interesting new insights into the whole-new oncology field in rapidly acquired resistance, and discover novel anti-tumor targets.

新近研究显示FGF-2通路作为一条酪氨酸激酶受体信号途径，可促使NSCLC细胞在1-2天内产生针对靶向治疗的"快速获得性耐药"。本课题组在两种NSCLC细胞株中添加EGFR-TKI后, 发现不仅细胞内的EGFR表达被阻断，还出现FGFR2蛋白和mRNA的表达上调，初步证实FGF-2信号可在部分NSCLC细胞株中被EGFR-TKI激活，但其介导耐药的具体作用机制亟需进一步明确。本研究拟继续在NSCLC细胞株中进一步诱导出针对EGFR-TKI的快速获得性耐药状态；以细胞的增殖、凋亡、侵袭和耐药相关分子标记的突变情况为观察指标，评估其耐药情况，并以aRNA芯片技术对一系列下游信号分子进行检测，筛选出相关的信号分子蛋白，以阐明FGF-2信号通路介导EGFR-TKI快速获得性耐药的分子通路机制，拓展肿瘤"快速获得性耐药"这一全新领域的研究，并发现新的抗肿瘤作用靶点。

FGF-2又称bFGF（basic fibroblast growth factor, bFGF），是由FGF基因家族编码的结构相关的蛋白质。FGF-2过表达与肿瘤发生发展、肿瘤转移、血管生成及预后密切相关。FGFR 是一类单次跨膜的酪氨酸激酶受体，其中FGFR-1和FGFR-2是FGF-2的高亲和力受体，配体与受体结合后可激活下游的信号通路(包括PKC、RAS和MAPK通路)，从而介导一系列重要的生理作用。研究证实多种肿瘤可通过FGF-2过表达改变bFGF/FGFR信号通路从而促进肿瘤生长；亦有研究指出，FGFs-FGFRs的自分泌信号通路在吉非替尼耐药的NSCLC细胞株中得到明显活化以及NSCLC细胞株中FGFR2抑制－再激活之后，肿瘤细胞能够针对EGFR-TKIs发生快速获得性耐药。然而这条通路所介导EGFR-TKIs发生快速获得性耐药的信号网络、分子机制及其临床后果，目前仍然缺乏相应的研究支撑，亟需进一步的探究。.本课题第一部分构建编码靶向FGF-2基因shRNA及基于PAS（PCR-based Accurate Synthesis）的慢病毒载体，包装慢病毒，感染人肺癌细胞PC-9，以荧光定量PCR检测FGF-2基因在mRNA水平的变化，以western blot 检测FGF-2蛋白表达水平的变化，筛选出FGF-2沉默表达/高表达的细胞株，为后续FGF-2在EGFR-TKIs耐药过程中的作用研究提供了有力的工具。 .本课题第二部分对FGF-2沉默表达（PC-9-FGF2- KD）及过表达细胞株（PC-9-FGF2-OE）单用吉非替尼或联用外源性FGF-2进行诱导，筛选并鉴定出耐药行为明显的细胞株，进一步确定了FGF-2参与在EGFR-TKIs所引发耐药过程中。.本课题第三部分利用Affymetrix人全基因组3’IVT芯片检测PC-9-NC、PC-9-FGF2- KD、PC-9-FGF2-OE，以及空白对照的PC-9细胞的差异基因表达改变，其中PI3K-AKT信号通路对FGF-2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的发生机制可能具有重要意义。