甘遂乳汁管发育过程中细胞自噬发生模式和机理的研究

The laticifer is a specialized secretory structure in plants, and its milk contains many unique metabolites, such as natural rubber, cardenolides, alkaloids and terpenes, which have wide application in industry and medicine. Euphorbia kansui Liou is a unique species to China, a traditional Chinese Medicine, and has non-articulated branched laticifers in whole plant. We detected that autophagy involved in cytoplasmic degradation through directly engulfing cytocol and organelles by autophagosomes and then fusing with lysosome-like vesicles during the development of laticifers in Euphorbia kansui. However, at present, whether the central vacuole is involved in autophagy during the development of laticifers, the mechanism of autophagy in laticifers is not clear. Therefore, this project intends to, based on the transcriptome and latex proteome of Euphorbia kansui response to methyl jasmonate (MeJA), through the differential expression analysis of autophagy related genes, autophagy process observation during the laticifer development after treatment of MeJA and autophagy inhibitors using qRT-PCR, laser confocal microscopy and transmission electron microscopy, reveal the occurrence pattern and molecular mechanism of autophagy in the process of laticifer development. Finally, using yeast two-hybrid technique to search the interaction network of the target autophagy related protein, thus providing a theoretical basis for the regulation of laticifer development.

乳汁管是植物体内的一种分泌结构，其乳汁中含有许多特有的代谢产物，在工业和医药上有广阔的应用前景，因此研究乳汁管的发育调控具有重要的理论实践意义。甘遂为我国特有植物，传统中药，全株具有无节分枝乳汁管—一个单细胞体系。我们检测了细胞自噬在甘遂乳汁管发育过程中的发生，发现乳汁管可通过形成自噬体，并与类溶酶体小泡融合进行原生质的降解。但是，目前关于乳汁管发育过程中自噬的发生模式，乳汁管细胞自噬发生机理还不清楚。故本项目拟以甘遂为材料，在茉莉酸甲酯不同时间诱导的甘遂比较转录组和乳汁的蛋白质组学基础上，利用实时荧光PCR、激光共聚焦显微镜以及透射电子显微镜技术，通过对茉莉酸甲酯、细胞自噬抑制剂分别处理后，乳汁管发育过程中自噬相关基因的表达分析及自噬发生过程的观察，阐明乳汁管发育过程中细胞自噬的发生模式，再利用酵母双杂交技术，获得目标自噬相关蛋白的互作网络，从而为乳汁管发生发育的调控研究提供理论基础。

以甘遂为材料，在分析茉莉酸甲酯响应的比较转录组和乳汁蛋白质组学基础上，通过对乳汁管发育过程中自噬相关基因的表达分析及自噬发生过程的观察，探讨乳汁管发育过程中细胞自噬发生的动态变化及模式，并获得目标自噬相关蛋白及其互作蛋白。研究结果如下：1.完成了茉莉酸甲酯响应的甘遂比较转录组学分析，发现外源茉莉酸甲酯喷施不同时间可以影响甘遂自噬通路的调控。2.完成了MeJA响应的甘遂乳汁比较蛋白组学研究，在所有的自噬相关蛋白中只有ATG18a被鉴定到，且MeJA促进了甘遂乳汁中自噬溶酶体途径及ROS途径相关蛋白的转录表达。3.利用单丹磺酰戊二胺作为类溶酶体结构的探针，结合抗ATG8/ATG18a抗体和Alexa Fluor488监测自噬强度的变化。ATG8和ATG18a的荧光强度随着乳汁管细胞的发育表现为弱-强-弱的变化趋势。此外，免疫印迹结果也显示MeJA处理后ATG8a和ATG18a的含量明显高于对照组，且随着MeJA处理时间呈先上升后下降的趋势。说明甘遂乳汁管发育过程为发育性自噬，MeJA促进了甘遂乳汁管细胞中自噬的发生。通过透射电子显微镜观察发现MeJA处理后，乳汁管细胞中自噬体的数量明显增多，主要表现为线粒体自噬，以此推测MeJA可能通过诱导细胞内ROS的增加，导致细胞的线粒体损伤，上调ATG8和ATG18a转录水平的表达而促进自噬发生。类溶酶体结构和ATG8/ATG18a探针的荧光可以共定位，而液泡中无荧光信号，说明乳汁管中细胞自噬的发生模式是自噬体与类溶酶体结构发生融合降解其中的包含物。4.建立甘遂cDNA文库，通过酵母双杂交技术筛选出ATG18a互作蛋白RaBD2c，双分子荧光互补和Co-IP技术验证二者发生互作，细胞定位分析和BIFC均验证它们在细胞质中发生互作。以上研究结果可为乳汁管发生发育的调控提供科学依据，乃至可为具有无节乳汁管的一大类植物的开发应用提供理论指导。