水稻种子耐盐萌发相关基因GSS1的克隆及功能研究

It is of great significance for cultivating salt-tolerant rice varieties with high seed vigor, and then for direct seeding and mechanized-transplanting cultivation in rice production, by cloning and functional identification of genes related with seed germination under salt stress in rice. In our previous study, a salt-sensitive mutant at the seed germination satge named as gss1 (Germinability under Salt Stress) was identified from japonica cv. Nipponbare by ethyl methanesulfonate (EMS) treatment. One F2 population derived from gss1 and Nipponbare was constructed, and three candidate genes controlling seed germination were identified under salt stress condition by MutMap method. In this study, the functional identification of gene GSS1 will be conducted using the mutant and transgenic rice plants. Meanwhile, through physiological, biochemical, as well as molecular and bioinformatic techniques, the possible mechanism of GSS1 will be explored. The results will serve as the genetic improvement of rice seed vigor in future.

挖掘水稻种子耐盐萌发相关基因，揭示种子耐盐萌发分子机理，有助于培育耐盐高活力水稻品种，对盐碱地区直播稻和机插秧等水稻轻简栽培具有重要意义。本研究前期利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变水稻日本晴材料，从中筛选到一份种子萌发期盐敏感突变体gss1（Germinability under Salt Stress），利用gss1突变体与野生型日本晴杂交构建F2分离群体，通过MutMap方法鉴定到3个在盐胁迫下控制种子萌发相关的候选基因。本项目拟进一步克隆GSS1候选基因，构建突变体和转基因植株，结合盐胁迫下萌发表型鉴定，验证目标基因功能；通过生理生化、基因表达及基因参与的信号通路分析，探讨基因GSS1参与盐胁迫下种子萌发的作用机理，为今后水稻种子活力遗传改良提供基础。

随着盐碱地区直播稻和机插秧等简约栽培模式的推广，亟待解决水稻种子萌发耐盐性品种匮乏的难题。前期利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变水稻日本晴突变体材料，通过MutMap抗感混池高通量重测序技术，鉴定到3个目标候选基因。.在此基础上，本项目通过三个候选基因仅含有单个碱基突变的EMS突变体，初步确定钾离子转运体OsHAK9为GSS1目标基因，同时通过T-DNA插入突变体、互补、过表达与CRISPR/Cas9点突变体转基因株系验证了该基因萌发耐盐功能。进一步，基因表达分析显示，OsHAK9在种子和萌发中高度表达，显著受盐诱导，且亚细胞主要定位于细胞膜上。利用酵母缺陷体CY162发现，OsHAK9具有显著地转运钾离子能力。通过钾钠离子含量测定，显示突变体hak9在盐胁迫下种子因钾离子外排而丢失，进而改变了种子萌发中钾钠离子平衡。外施试验显示，赤霉素（GA）可以部分恢复突变体hak9盐胁迫下种子萌发盐敏感性。进一步利用转录组差异基因分析，发现OsHAK9广泛参与了非生物胁迫基因转录调控，且GA分解代谢基因LOC_Os01g11150和LOC_Os05g3569在突变体hak9中显著下调。为进一步确定GSS1与GA的关联性，我们通过GA合成和分解代谢相关基因RT-qPCR分析，发现OsHAK9参与GA代谢主要通过GA分解代谢途径调控种子耐盐萌发。除此之外，我们还发现OsHAK9与调控种子活力关键基因qLTG3-1存在密切关系，其萌发耐盐性也有可能通过调控qLTG3-1基因表达作用种子萌发耐盐。.综上所述，本项目克隆了水稻萌发耐盐基因GSS1，且初步阐明该基因通过主要影响种子萌发过程盐胁迫下钾钠离子平衡，以及GA分解代谢途径调控种子萌发耐盐性。本项目研究工作，有助于进一步揭示盐胁迫下水稻种子萌发分子遗传机理，对水稻种子萌发耐盐品种改良具有重要的参考价值。