FusKR调控迟缓爱德华菌定植宿主细胞的分子机制

Edwardsiella tarda (E. tarda) is an important zoonotic pathogen, which particularly infect aquaculture animals. This disease is responsible for larger economic losses to aquaculture. The gastrointestinal tract is a portal of entry for E. tarda, suggest that colonization of E. tarda may be related to Two-component system of FusKR which can promote virulence after sensing the fucose signals. But it is a pity that we understand the FusKR of E. tarda. Therefore, this study intends to resolve the pathogenicity and the expression of FusKR key genes in different virulence of E. tarda after fucose treated. Clone and express the key gene of FusKR, and then prepare antibody of FucP, FucK and FucR. Establish the method to determinate FucP transit fucose, enzymatic or phosphorylation activity of FusK or FusR. Construct the key gene of FusKR deletion strains, analyze the key gene of FusKR transcription, expression, particularly the enzymatic activity or phosphorylation of FucK or FucR after one gene deletion. Reveal the function and interaction of FusKR key genes. Furthermore, analyze the important pathogenicity island candidate gene using RNA-seq method, and identify the key protein using iTRAQ method when E. tarda colonize host cells. Preliminary clarify the molecular mechanism of E. tarda colonization host cells regulated by FusKR.

迟缓爱德华菌是一种重要的人畜共患病原菌，尤其危害水产养殖动物，造成严重经济损失。研究发现肠道是该菌最易定植的器官，推测与响应岩藻糖信号并调控毒力岛基因表达而增强定植的双组分信号转导系统FusKR相关，但对其认识非常欠缺。本研究拟解析岩藻糖对不同毒力迟缓爱德华菌的致病性及FusKR关键基因（fucP、fusK和fusR）差异表达的影响；克隆、表达FusKR关键基因，制备抗体，建立检测FusKR关键基因转录、表达差异和关键蛋白FucP、FucK、FucR的活性与磷酸化的方法；构建FusKR关键基因的缺失株，分析基因缺失对FusKR关键基因转录、表达、活性或磷酸化的影响，揭示FusKR关键基因的功能与相互作用；用RNA-seq、iTRAQ方法分析FusKR效应蛋白调控迟缓爱德华菌定植宿主细胞的重要候选基因/毒力岛与关键蛋白。初步阐明FusKR介导岩藻糖信号调控迟缓爱德华菌定植宿主细胞的分子机制。

迟缓爱德华菌是一种重要的人畜共患病原菌，研究其定植机理对于控制该病原菌具有重要的意义。本项目主要开展了岩藻糖调控迟缓爱德华菌双组分信号转导系统FusKR和毒力岛基因增强迟缓爱德华菌定植能力的研究。本研究解析了岩藻糖对不同毒力迟缓爱德华菌的致病性及FusKR关键基因（fucP、fusK和fusR）差异表达的影响；克隆了FusKR关键基因，建立了检测FusKR关键基因转录、表达和关键蛋白FucP、FucK、FucR的转录、表达的方法；构建FusKR关键基因的缺失株ΔfucP，分析基因缺失对FusKR关键基因转录、表达及活性的影响，证实了FusKR关键基因的功能与相互作用；解析了FusKR对迟缓爱德华菌III型分泌系统的调控作用及诱导宿主关键细胞因子的作用。研究结果表明，FusKR关键基因的缺失株ΔfucP的生理生化特征与野毒株相比无明显变化，且在DHL平板上培养都显示黑色菌落，在加入岩藻糖时都能提高缺失株和野毒株的生长速度，表明该基因缺失并没有影响岩藻糖的利用。但是，2株细菌对斑马鱼的致病性发生了明显差异，野毒株的半数致死量是3.4x104 CFU/尾，缺失株的半数致死量是6.0x105 CFU/尾；基因缺失影响了该细菌的运动能力，在粘蛋白模拟试验中定植的细菌数显著降低；应用罗非鱼肠道定植试验也证实，定植肠道的细菌数也显著降低；当加入岩藻糖培养时，野毒株的岩藻糖相关基因 fucP、fucK和fucR的表达显著高于缺失株；加入岩藻糖对野毒株和缺失株的III型分泌系统相关基因影响显著，效应蛋白基因(eseB、esec、eseD、eseE、eseG )、结构蛋白基因 (esaB、esaD、esaK、esaL )、调节蛋白基因 (esrA、esrB、esrC )和伴侣蛋白基因 (escA、escB )都显著高于未加入岩藻糖的情况，同时缺失株的表达水平是野毒株的0.37到 0.65倍不等。野毒株和缺失株感染宿主后，对宿主头肾、后肾和脾脏中的主要细胞因子IL-1β、INFγ、TNF-α、caspase3、TGF-β和HSP70也有不同程度的诱导作用。结果表明，迟缓爱德华菌FusKR调控T3SS表达，增强该菌对细胞和宿主的感染和定植能力。