水牛胎儿成纤维细胞诱导为多能干细胞的初步研究

本研究拟探讨导入特定转录因子诱导水牛胎儿成纤维细胞（BFF）成为多能干细胞（iPSCs）的可行性。应用RT-PCR扩增克隆水牛转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28、Utf16和p53 基因全长ORF片段。一方面，将转录因子和EGFP标记基因定向克隆于pMSCV载体上，通过转染筛选PT67细胞系，获得包含相关基因的病毒，然后感染体外培养的BFF，诱导获得水牛iPSCs；另一方面，构建穿膜肽（TAT）融合转录因子原核表达载体，表达并纯化获得穿膜肽转录因子融合蛋白质，通过添加这些融合蛋白使水牛BFF诱导成为iPSCs。通过形态观察、多能细胞标记基因表达检测等对获得的水牛iPSCs进行鉴定，并通过体外诱导分化试验和体内畸胎瘤形成试验，验证其分化成三个胚层的潜能。研究结果将对提高水牛的克隆和转基因克隆效率，推动转基因水牛新品种培育的进程具有重要意义。

采用特异性转录因子，将体细胞重编程为具有干细胞特性的诱导多能干细胞，为胚胎干细胞建系困难的家畜提供一种获得多能干细胞的新途径。尽管研究人员对水牛生殖干细胞和胚胎干细胞进行了多次建系探索，但进展缓慢。本课题通过导入特定转录因子Oct4, Sox2, Klf4 和 c-Myc成功的将水牛胎儿成纤维细胞诱导为多能干细胞（biPSCs）。所获得的biPSCs呈现出典型的多能干细胞特征，保持了正常核型，保持AP染色阳性，并表达了Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, E-Cadherin, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-81, STAT3 和FOXD3多能干细胞基因. 在体外培养可以分化成拟胚体，注入BALB/C系裸鼠后获得了三胚层的畸胎瘤。甲基化分析显示biPSCs中Oct4 和Nanog基因启动子 甲基化水平较BFF细胞大大降低. 我们还发现通过导入转录因子的同时导入SV40大T抗原，可以抑制p53基因的表达，提高biPSCs克隆的产生效率3倍以上。 本课题研究结果表明，可以通过向水牛胎儿成纤维细胞导入特定的转录因子，使其重编程为biPSCs，这一过程可以通过抑制p53基因的表达效率得以提高。水牛诱导多能干细胞的研究成果，对阐明 水牛干细胞分化机制，以及应用biPSCs对水牛进行遗传改良奠定了良好的工作基础。