原始态(naive)和始发态(primed)水牛诱导多能干细胞的研究

In this study, we focus on study the differences between na?ve and primed buffalo iPSC in biology characterization ,mechanism of maintaining the pluripotent state, DNA methylation modification and the ability to contribute to chimera, and using buffalo iPSC for generation trangenic-cloned buffalo. Buffalo transcription factors Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc and miRNA302/367 will be used to generate the na?ve and primed buffalo iPSC. To establish the buffalo iPSC cell lines, the lentivirus vectors expressed LIF and bFGF will be constructed, and used for generation of LIF and bFGF-conditioned iPSC culture medium. The identification of na?ve and primed buffalo iPSC include the culture condition, the charateristics of pluriptency, gene expression profiling, the pluripotency-related core signaling pathways, X chromosome inactivation, the methylation status of the pluripotency -related genes, the differentiation potential in vitro and in vivo,and the ability to contribute to chimera. At last, how to use the two types of buffalo iPSC for generation transgenic-cloned buffalo will be investigated, and the developmental potential of iPSC derived-embryos will be identified.These efforts will provide important theoretical and practical basis for establishing buffalo pluripotent stem cell line and buffalo genetic improvement.

本研究拟探讨原始态（naive）和始发态（primed）两种重编程状态水牛诱导多能干细胞（biPSC）的生物学特性、维持多能状态的机理、DNA甲基化修饰和嵌合能力等的差异，并将biPSC用于生产转基因克隆水牛。使用水牛转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc结合水牛microRNA302/367重编程水牛体细胞为原始态和始发态的biPSCs。构建表达水牛bFGF和LIF的载体，使用水牛源bFGF和LIF诱导条件培养基对biPSCs培养建系。对两种状态水牛biPSC进行差异鉴定，主要包括培养条件、多能性、基因表达谱、维持各自多能性主要信号路径、X染色体失活、多能性基因启动子区甲基化水平、分化潜能和形成嵌合体能力等。探索两种状态的biPSC用于转基因克隆水牛生产的技术体系，鉴定iPSC克隆胚胎发育潜能。这些研究将为水牛干细胞的建系和应用于水牛遗传改良提供重要的理论和实践依据。

诱导多干细胞（iPSCs）是一种来源的体细胞重编程的多能干细胞。由于目前来源于大家畜（包括水牛）的胚胎干细胞受到胚胎来源、克隆形成率和培养体系等问题的制约，影响了水牛干细胞的研究和应用。采用新重编程技术获得多能干细胞的方法对水牛多能干细胞研究和应用具有重要意义。目前认为诱导多能干细胞会出现两种多能状态，一种是始发态（primed），一种是原始态（naive），原始态多能干细胞具有更高的多能性和分化潜能。本研究对水牛原始态和始发态诱导多能干细胞进行研究，探索两者的差异，维持多能性机理，分化潜能和形成核移植重构胚的能力。结果表明，病毒载体介导的OSKM转录因子或联合miRNA302可以将水牛胃细胞和脂肪间充质细胞重编程为水牛iPSCs，并呈现两种不同多能状态的形态特征。构建水牛源LIF和bFGF表达载体，生产条件培养基，在低氧环境下可以将水牛biPSCs培养15代左右，Forsklin、Kenpaullone促进始发态向原始态转变。两种状态水牛biPSCs都具有多能性和分化能力，表达多能性标志基因，分化形成拟胚体和畸胎瘤，但都无法形成嵌合体。其次，LIF和bFGF信号通路在重编程中均具有重要作用，特别是bFGF下游通路PI3K-AKT在水牛原始生殖细胞重编程为类胚胎生殖细胞（EG-like）的过程中发挥重要作用，所获得的EG-like具有干细胞特有的生物学特性。两种biPSCs差异鉴定表明：原始态biPSCs特异表达SSEA1，REX1，部分细胞具有两个活性染色体，具有单克隆形成能力；始发态biPSCs特异表达FGF5，染色体失活，Oct4启动子区甲基化程度高，不能使用胰酶消化传代。最后，biPSCs来源的重构胚具能发育到囊胚阶段，但效率低（~5%），大多数重构胚发育到2-4细胞阶段便停止发育，没有获得克隆后代。以上结果将为水牛多能干细胞的研究提供新的见解。