髓样分化蛋白-2在单核/巨噬细胞膜上致炎位点的钓取及其拮抗多肽筛选

髓样分化蛋白-2(MD-2)是内毒素(LPS)活化TLR4跨膜信号通路所必需的受体分子，特异性阻断其致炎效应是拮抗内毒素治疗的有效策略，但MD-2在单核/巨噬细胞胞膜上的致炎位点目前尚不清楚。我们在前期研究中发现自主设计构建的新型MD-2模拟肽(MDMP)可通过与MD-2竞争结合小鼠巨噬细胞膜表面的作用位点，抑制LPS致炎效应，提示该位点可能是MD-2的致炎位点。本项目拟利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-pull down技术钓取与MDMP结合的细胞膜蛋白，二维凝胶电泳分离该蛋白并进行质谱鉴定；通过蛋白组库比对筛选靶蛋白，并经构建靶蛋白siRNA明确MD-2致炎位点及其多肽序列；进一步利用噬菌体展示肽库筛选针对该位点的高亲和性拮抗多肽，在体内外深入研究拮抗多肽对LPS诱导的过度炎症反应的抑制效应。这对于探索创/烧伤感染所致脓毒症新的治疗策略和途径将具有重要的科学意义和潜在的应用价值。

髓样分化蛋白-2(MD-2)是内毒素(LPS)活化TLR4跨膜信号通路所必需的受体分子，特异性阻断其致炎效应是拮抗内毒素治疗的有效策略，但MD-2在巨噬细胞胞膜上的致炎位点目前尚不清楚。本项目主要研究内容是利用Pull down技术钓取与MDMP/MD-2结合的巨噬细胞膜蛋白，经分离鉴定获取MD-2致炎位点及其多肽序列，进一步利用噬菌体展示肽库筛选针对该位点的高亲和性拮抗多肽。目前已经取得下列重要结果：.1、以6XHis标记的MDMP为诱饵蛋白，经Pull Down技术获取到可与MDMP结合的的巨噬细胞膜蛋白，并经Tricine-SDS-PAGE电泳证实Pull Down洗脱液中存在差异条带。.2、分别分离差异条带蛋白和Pull Down全蛋白样品经ESI-QUAD-TOF进行质谱分析鉴定，结合数据库分析，筛选获得与MDMP结合的胞膜蛋白分子，包括CH60、S10A4、RAB10、IRAK2、ILRL1、MSRE等。.3、免疫印迹分析显示提取的全膜蛋白和Pull-down洗脱液中均可检测到上述蛋白条带，表明钓取到了MDMP的相互作用蛋白。进一步干预研究显示MDMP预处理对RAB10、MSRE、TLR4 mRNA表达量均有不同程度影响，证实MDMP与获取的蛋白存在相互作用。.4、通过序列比对获得MD-2在Toll-4受体上的结合位点多肽序列，固相合成该多肽MBT24并以其为靶分子，经噬菌体展示随机12肽库亲和筛选，获得与MBT24高亲和性结合的噬菌体克隆。挑选3批次共55个克隆和10个对照克隆进行测序,38个克隆和9个对照克隆得到可靠测序结果。.目前的研究结果表明MDMP拮抗内毒素的作用位点并不单一，可能存在多个作用蛋白位点和多种作用方式，具体作用机制有待进一步深入研究。..