BRD4调控B细胞功能的机制及其在抗体介导的排斥反应中的作用研究

Antibody-mediated rejection(AMR) is one tough barrier to further improve long-term graft survival in transplantation. There are unfortunately no effective regimens to overcome it AMR development is high correlates with deposition of donor specific antigen-antibody complexes in graft and chronic further tissue damage. Thus intervention of donor specific antigen-antibody production can resolve the issue fundamentally. In previous study, result indicated BRD4 inhibitor could markdly reduced serum antibody production and prolonged graft survival in murine cardiac transplantation modle. In this study, we intend to investigate the effect of BRD4 on regulating B cell phenotype and AMR according to characteristics and clinical importance of B-cell-mediated AMR. Researching the effect of BRD4 on regulating B cell characteristics，functions and phenotype by CRISPRa/I system. BRD4 molecular function including those in B cell activation and antibody production during AMR development can be definite by ATAC-Seq and ChIP-Seq. Establishing BRD4 B cell conditional knockout mouse, then using AMR model to clarify BRD4 function in vivo and detect key genes in BRD4 cascade. This study could provide new strategies to AMR prevention and futher undersatanding the role of molecular regulating mechanisms of BRD4 regulating B cells.

抗体介导的排斥(AMR)已成为影响临床移植物远期生存的重要障碍，其发生机制与排斥性抗体产生及抗体-供者抗原复合物在移植物中沉积和由此介导的慢性损伤密切相关，故此干预排斥性抗体的形成是解决该难题的关键。前期研究发现，溴结构域蛋白4(BRD4)抑制剂可以显著降低同种移植小鼠抗体产生、延长移植物存活期。本课题拟研究BRD4调控B细胞的功能及其对AMR的作用。采用CRISPRa/i技术研究BRD4对B细胞生物学表型、特性和功能的作用；ATAC-Seq结合ChIP-Seq明确BRD4如何调控B细胞活化与抗体产生，分析调控作用的分子机制；寻找并鉴定BRD4下游调控B细胞的关键分子，体内外研究其作为调控B细胞功能分子新靶点的可能性；构建条件敲除小鼠，采用AMR模型研究其调控B细胞的体内效应及其对体液介导的排斥的防治效果，为深入认识BRD4调控B细胞的分子机制及防治AMR提供数据。

抗体介导的排斥(AMR)已成为影响临床移植物远期生存的重要障碍，其发生机制与排斥性抗体产生及抗体-供者抗原复合物在移植物中沉积和由此介导的慢性损伤密切相关，故此干预排斥性抗体的形成是解决该难题的关键。前期研究发现，溴结构域蛋白4(BRD4)抑制剂可以显著降低同种移植小鼠抗体产生、延长移植物存活期。本课题拟研究BRD4调控B细胞的功能及其对AMR的作用。采用CRISPRa/i技术研究BRD4对B细胞生物学表型、特性和功能的作用；ATAC-Seq结合ChIP-Seq明确BRD4如何调控B细胞活化与抗体产生，分析调控作用的分子机制；寻找并鉴定BRD4下游调控B细胞的关键分子，体内外研究其作为调控B细胞功能分子新靶点的可能性；构建条件敲除小鼠，采用AMR模型研究其调控B细胞的体内效应及其对体液介导的排斥的防治效果，为深入认识BRD4调控B细胞的分子机制及防治AMR提供数据。根据研究计划，我们首先探讨了基于蛋白水解靶向嵌合体(Proteolysis-targeting chimera，PROTAC)技术的药物BETd-260对BRD4蛋白的高效降解作用，探究了其是否依赖泛素-蛋白酶体降解机制，并对其作用的时间依赖性和剂量依赖性进行描述。接着我们表征了BETd-260对肝癌细胞系增殖及凋亡的影响，探讨其潜在治疗价值。随后我们研究了是否BETd-260可以通过降解BRD4，诱导免疫原性死亡，从而增强肝癌治疗效果，这部分我们对内质网应激相关蛋白、ROS等进行了表征，同时也对BETd-260处理过的细胞作为免疫疫苗，是否能进一步活化DC，进而激活适应性免疫进行了探讨。考虑到BRD4在体内泛表达，为了降低药物的毒性，提高药物治疗效果，我们构建了靶向GPC3的外泌体靶向递送体系，并对其表型、细胞摄取、体外稳定性及体内外靶向性进行了测定。最后我们构建了人源性皮下荷瘤模型，探讨了靶向递送PROTAC-BRD4的良好安全性及疗效。