基于膜蛋白定点修饰的重组病毒载体结构基础、输送靶向性及免疫原不良反应关系研究

With the aim to broaden the versatility of viral vector as a tool in gene therapy, we expand the genetic code in propagation of lentiviral vectors and adeno-associated vectors for site-specific incorporation of chemical moieties with unique properties. Through systematic exploration of the structure-function relationship of viral vectors by site-specific displaying azide- and other chemical moieties, the modifiable sites on vector surface are identified that neither affect the expression of envelope protein nor propagation or infectivity of progeny virus. Furthermore, via such incorporated chemical moieties a variety of probe, ligand and other functional molecules are conjugated, orthogonally and stoichiometrically, to viral vector to enhance their precise targeting as gene delivery vectors. Furthermore, via the introduction of the targeting entities at different sites, the structure of modified viral envelope and immunogenicity relationship are explored. By such a methodology a facile platform is established that will be demonstrated useful for tracking and targeting gene delivery of therapeutic genes such as TK suicide gene, shRNA-gene knockdown and CRISPR-mediated repairing systems. This study may provide a new direction for rational design of viral vector with significant impact on both basic research and therapeutic applications.

基因治疗是指借助于病毒载体或其它介质，将具有治疗作用的外源基因导入含缺陷基因的细胞内，替代、修复或干预缺陷基因，从源头根除致病诱因。然而病毒载体感染的非选择性及其免疫原性等不良反应阻碍了基因治疗的发展。本项目将基于前期建立的“基于基因密码扩展的在体蛋白质标记”新方法，探索在慢病毒和腺相关病毒膜蛋白的任意位点选择性引入化学功能团，建立温和、快速、高效、定量和特异引入靶头分子的方法，进而揭示重组病毒载体的结构与靶向性和免疫原性的关系，发现病毒载体膜蛋白的可修饰位点和不/低诱发免疫副反应的重组表位结构。更进一步，基于重组病毒载体的构效关系，设计和优化带靶头的新型病毒载体，提高其对特定细胞和组织的感染选择性，降低重组病毒载体免疫原性；同时构建含非天然氨基酸生物正交系统、并可高效包装自杀基因和shRNA沉默以及CRISPR修复系统的全新细胞株，为基因治疗用病毒载体的更新换代提供理论指导和实验依据。

基因治疗是指借助于病毒载体或其它介质，将具有治疗作用的外源基因导入含缺陷基因的细胞内，替代、修复或干预缺陷基因，从源头根除致病诱因。然而病毒载体感染的非选择性及其免疫原性等不良反应阻碍了基因治疗的发展。本项目旨在探索活病毒/病毒载体的任意或特定位点 - 高效引入非天然氨基酸/非天然糖方法，进而温和、快速、高效、定量和特异引入功能性分子，实现病毒/载体表位结构、靶向感染性和免疫原性构效关系研究，为基于病毒的仿生药物和生物治疗研究提供原创性理论、方法和策略。取得的重要进展包括：1）复制缺陷型活病毒疫苗的研发获得突破性进展，课题组以甲型流感为模型，在含有生物正交翻译系统的稳定细胞系中, 应用遗传密码子扩展技术成功制备了复制缺陷型或病毒疫苗，此类疫苗保留了野生型病毒的全部抗原、感染活力和感染途径，可以诱发人体产生强而广的体液免疫、鼻腔黏膜免疫以及T-细胞活化免疫应答，但在人体内复制能力缺失，具有良好的安全性。该项研究成果颠覆了病毒疫苗的传统理念，创新性的开创出一种活病毒疫苗的通用方法，已申报PCT专利。2）光控病毒载体的研发推动新的生物治疗技术和国家创新药物重大专项的立项：课题组针对作为免疫治疗的CAR-T的制备过程复杂、门槛高以及体内持续激活致细胞因子风暴等限制因素，开发了“多肽链介导通用型CAR-T对自身免疫性疾病患者体外B细胞的杀伤”以及“光可断裂连接臂介导通用型CAR-T对肿瘤的杀伤”，在可调控、通用型CAR-T干预自身免疫疾病和肿瘤的研究方面取得进展。