基于多价免疫生物传感器的原料乳中多种蛋白高通量检测新方法研究

牛奶富含蛋白质、钙、维生素及矿物质，是除母乳外最接近完美的食品。牛奶中蛋白质含量是衡量其营养价值高低的一项重要指标。检测牛奶中蛋白质的现行国标法- - 凯氏定氮法是根据总氮含量计算蛋白质含量。不法商家利用其检测漏洞非法添加可使蛋白质含量虚高的含氮类非食品添加剂，造成重大食品安全事故，如2008年9月发生的震惊中外的"三聚氰胺事件"。为了从根本上解决这一问题，本研究拟利用纳米金技术、细胞融合技术和免疫学技术等，构建直接针对牛奶中主要蛋白的集"特异性"和"多价性"于一体的免疫生物传感器，以此传感器为探针，探讨牛奶中主要蛋白的简便、快捷、灵敏的高通量直接筛检方法。本研究避免了现行检测方法的弊端，从理论上使添加各种含氮类非食品添加剂的行为变得毫无"意义"。本项目的实施将为原料乳中蛋白质检测的新方法和新技术提供理论和实验基础。为牛奶及奶粉中非食品添加剂的监管与控制提供技术支撑。

合成了纳米金粒子（AuNPs）和纳米磁珠（IMBs）探针，建立了系列检测牛乳中主要蛋白的分析平台。.1. 制备了抗β-酪蛋白的McAb和PcAb，并分别修饰AuNPs，建立了β-酪蛋白的双抗夹心ELISA和AuNPs聚集比色法。线性动态范围和最低检测限分别为0.08-250 μg/mL和0.03 μg/mL。该方法的优点是灵敏性高、特异性强、不需要复杂样品处理 [Food Chemistry, 2013, 141 (1): 167-173. (IF = 3.259); Food Chemistry, 162 (2014) 22–26. (IF = 3.259)]。.2. 以免疫磁珠(IMBs)为固相载体，以包被在磁珠上的抗β-酪蛋白McAb（IMBs-McAb）为捕获探针，以标记HRP的抗β-酪蛋白PcAb （HRP-PcAb）为检测探针，建立了β-酪蛋白的IMBs-ELISA 。检测限为0.4 μg/mL, 检测前只需要将样品稀释100倍，30分钟即可完成整个检测过程 [Food Chemistry, 158 (2014) 445–448. (IF = 3.259)]。.3. 建立了以PcAb包被MBs （PcAb-MBs）为捕获探针，以McAb包被 AuNPs和HRP （McAb-AuNPs-HRP）为信号放大探针，与β-酪蛋白形成三明治结构（MBs-PcAb–β-酪蛋白-McAb–AuNPs）的双纳米粒子检测体系。HRP作为酶促反应驱动剂，催化底物产生的光信号与β-酪蛋白的量成正向相关，敏感性是传统ELISA的6～7倍[Biosensors and Bioelectronics, 66 (2015) 559-564. [IF = 6.451]]。.4. 用HRP和抗κ-酪蛋白的McAb双标记AuNPs，其中McAb和HRP分别作为探测器和信号放大催化底物，合成了κ-酪蛋白特异性探针。线性反应范围为4.2 ng/mL～560 ng/mL，敏感性比传统HRP-IgG高10倍[Biosensors and Bioelectronics, 61(2014) 241–244.[IF = 6.451]]。