基于纳米标记与传感阵列的磷酸化蛋白高灵敏高通量检测新方法

Protein phosphorylation is a major regulatory mechanism that controls almost all life activities of each basic cellular process. Accordingly, phosphorylation analysis, in particular the quantitative measurement of phosphoproteins becomes a hot topic of many research areas including Life Science, Chemistry and Medicine. In light of some difficulty issues of current methods for phosphorylation analyses such as complex operation, expensive cost, sensitivity and accuracy is required to be improved, this project will establish nanoparticles-based labels and nano-biosensor arrays for measurement of phosphoproteins and related biomarkers with high sensitivity and high throughput. This research will not only explore the dynamic mechanism of molecular recognition between the probe and the phospho-biomarkers, but also discuss the adsorption and electronic transfer mechanism of proteins in nano-interface. The study in this proposal also includes quantitative analysis of the sites of phosphoproteins and new technology for simultaneous detection of multiple phospho-biomarkers. Combined with flow injections, test strip and screen printing technology, this project is primary aimed at developing sensitive, low-cost, simple and practical diagnostic tools for phospho-biomarkers and will potentially produce better immunoassay method and novel devices. We believe that the implementation of this project will establish new technology for quantification of phosphoproteins and phospho-biomarkers, which has great clinical significance in early diagnosis and treatment of cancer and other disease.

蛋白质磷酸化几乎调节着生命活动的每一过程，围绕着磷酸化蛋白的研究已成为生命科学、化学、医学等领域一个引人注目的焦点。本项目针对目前磷酸化蛋白检测方法操作复杂、价格昂贵、灵敏度与准确性尚需提高等难点，将构筑纳米生物标记物与纳米生物传感阵列，以实现基于纳米界面体系的磷酸化蛋白及关键生物标志物的高灵敏高通量检测。探讨探针分子与磷化蛋白及相关生物标志物的结合动力学过程，阐明蛋白质分子在纳米界面的吸附、识别与电子传递等作用机制。开展磷酸化蛋白质的多磷化位点定量分析与多态性分析的研究，建立多种磷化蛋白相关生物标志物的联合检测新技术。结合流动注射、免疫试纸条与丝网印刷电极技术开发高灵敏、低成本、简单实用的快速测定系统，以期获得生物标志物免疫分析新方法与新器件。相信通过本项目的实施，将建立磷酸化蛋白及关键生物标志物的定量测定新技术，对于癌症和重大疾病的早期诊断和治疗具有非常重要的科学意义和临床价值。

围绕磷酸化蛋白的研究已成为生命科学、化学、医学等领域一个引人注目的焦点。本项目围绕纳米标记与生物传感技术，开展了磷化蛋白及相关生物标志物的高灵敏检测新方法研究。.研究内容：（1）纳米生物标记物的可控合成与表征；（2）纳米生物传感器件和阵列研制；（3）探针分子与磷化蛋白及生物标志物的动力学结合过程研究；（4）快速检测器件开发。.重要结果及其科学意义：（1）胆碱酯酶（ChE）在丝氨酸198号位点磷酸化导致其活性大大降低，磷化ChE已被广泛作为有机磷农药中毒的生物标志物。我们构建了双通道靶标酶传感器，并通过纳米金颗粒有效附集信号分子，实现了检测信号放大。构建的靶酶传感器克服了常规方法受到正常胆碱酯酶活性的个体差异性而无法准确检测低剂量有机磷农药中毒的难点。研究结果发表在Analytical Chemistry 2013, 85, 9686。（2）利用纳米TiO2对磷氧基团极强的亲和力和特异性识别作用，成功分离并富集了磷酰化胆碱酯酶复合物(OP-ChE)。该方法结合免疫试纸条的高效分离技术及电化学检测简便、灵敏且易于微型化等优点，整套装置灵巧便携，无需样品预处理，并将整体检测时间缩短至10分钟，为低剂量有机磷中毒的现场快速检测提供了新方法。研究结果发表在Biosensors and Bioelectronics 2013, 50, 486-491。（3）磷酸化蛋白的多生物标志物同时检测。由于大多数蛋白含有一个以上的磷酸化位点，因此对蛋白质的磷酸化位点的定量测定具有重要的意义。我们开展了多生物标志物磷酸化蛋白（p5315, p53392）的同时检测的研究。该方法以蛋白质笼为载体，构筑了两种靶向纳米标记物（Pb-Apo, Cd-Apo）用于特异性识别并放大检测信号。研究结果发表在 Biosensors and Bioelectronics 2016, 80, 201-207。（4）开发低成本、简单实用的快速测定系统一直是分析科学者追求的目标。我们研制了基于血糖仪测定磷酸化蛋白phospho-p53(S15)的方法。该技术将血糖仪发展成便携式的磷酸化蛋白及生物标志物检测的测定仪，极大拓宽了血糖仪的应用，并简化了目标物的检测。该方法获授权专利（CN103353521B）。研究结果发表在 Biosensors and Bioelectronics 2015, 72, 348-354。