DNA纳米管双酶级联反应器的构建与性能研究

Recently, simulation of intracellular enzyme cascade has been one of the hot spot of research. High Concentration and effective transmission intermediate can be realized by constructing multi-enzyme cascade on nano-reactor to improve the efficiency of multi-enzyme cascade. DNA nanostructure has been emerged as promising molecular scaffolds to organize multi-enzyme cascade based on their programmable, nanoscale control and sequence-driven self-assembly. Compared with 1D or 2D DNA materials, few research has been focused on nanorecator based on 3D DNA Nanotubes. Here, minicircle DNA has been used to assemble two kinds of DNA nanotubes which would be used as scaffolds to construct an artificial enzyme cascade nanoreactor based on the D-xylose metabolic pathway. Taking the advantages of the high stability、rigidity and controllable enzyme recognition site, the well-build DNA nanotubes are quite suitable to construct nanorectors to simulate crowded cell-mimicking environments. Different DNA sequences can be recognized by zinc finger fused enzymes which can be expressed by bacteria in vivo. Future, the well-constructed bienzyme cascade nanoreactors would be used to explore how the cascade work inside the robust tubular environment. The proposed system could open up a cornucopia of opportunities for intriguing applications in more complex nanoscale reaction system.

模拟细胞内多酶级联反应是近年来研究的热点之一。基于纳米反应器构建的多酶级联反应可实现反应物或中间产物的限域化高浓度以及有效传输，以此提高多酶级联反应的效率。DNA纳米材料具有结构可编程性、纳米级别调控性和序列识别特异性等优点使其成为构建多酶纳米反应器优良载体。相比于一维、二维DNA纳米材料，具有管内空腔结构的三维DNA纳米管作为脚手架构筑多酶纳米反应器的报道较少。申请人拟基于环状DNA构筑两类新型的DNA纳米管脚手架用于构建基于木糖还原酶-木糖醇脱氢酶代谢途径的双酶级联反应器。该类DNA纳米管结构稳定、刚性强、酶的连接位点可控，因而可用作纳米反应器模拟限域的多酶级联反应。本项目中双酶分子通过锌指蛋白融合酶法在细菌体内表达制备，依据锌指蛋白融合酶对不同序列DNA特异性识别构建DNA纳米管级联反应器，并且研究DNA纳米管管路环境对双酶级联反应的影响，为今后实现更复杂反应的纳米调控提供指导意义。

DNA和胶原蛋白均为体内的生物螺旋大分子。相比DNA的双螺旋结构，胶原蛋白是三股螺旋结构，三条链呈拉链式交错排列，结构更为复杂。胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质也是细胞质基质主要组成部分。胶原蛋白异三聚体的三条链可以组成27种排列不同的三聚体结构。设计胶原异三聚体的难点问题在27种可能的三聚体中，形成且只形成单一的abc型异三聚体。采用正负设计理念，即计算所有可能的三聚体的状态，通过模拟退火算法优化序列，提高目标三聚体稳定性，降低其它竞争态稳定性的策略。在以前的研究中设计了由静电力介导的胶原蛋白异三聚体，并利用圆二色谱验证了异三聚体形成。在原子水平上验证了全新计算设计的方法在胶原蛋白序列设计的准确性与实用性。本研究中成功解析了第一个胶原蛋白异三聚体的晶体结构。在此基础之上，通过分子动态模拟，采集带电荷残基侧链相互作用中可能出现的各种构象，统计强静电作用出现的概率。基于晶体结构中的侧链相互作用，设计定点突变，破坏侧链间的静电引力，以圆二色谱测量热熔融温度的变化，估算侧链静电引力对胶原蛋白热稳定性的贡献。结合实验测定与动态模拟，提出了胶原序列设计的经验公式，可准确预测胶原蛋白的热稳定性。随后，以异三聚体abc为母体序列，设计饱和突变，利用圆二色谱实验测定饱和突变后横向及轴向相互作用。选取A链的第16位和B链第18位，设计其它19种氨基酸的饱和突变，分别测定只含有A链或B链单点突变的三聚体的稳定性，随后测试19×19=361种复合突变的异三聚体的热熔融温度。筛选出10个显著的轴向位（ΔT≥4℃）的作用力。这些作用力将作为胶原序列设计与天然胶原序列的热稳定性的预测，提供较为准确的力场，从而推动胶原蛋白设计向计算准确性、序列多样性、功能完善性等多方面发展。