金黄色葡萄球菌非编码小RNA相互作用蛋白的探寻及功能研究

Small noncoding RNA （sRNA） in bacteria has been reported to regulate a lot of virulence factors as well as some important physiological processes. Over a hundred sRNAs have been identified in Staphylococcus aureus and most of them have been proved to play roles in the virulence of S.aureus. While most research about the sRNAs is focused on the identification of novel sRNA and the direct interaction between sRNAs and their mRNA targets, little is known about the proteins involved in the generation and regulation of sRNAs. Based on a technical in use of RNA Streptavidin aptamers, we successfully pulled down the proteins binding to sRNAs. In this project, we aim to identify those proteins binding sRNA and investigate the interaction between sRNAs and those proteins. Whether these proteins influence the stability and the regulatory network of sRNAs will be a very interesting topic of our research. When confirmed, deletion of the genes encoding these proteins will be conducted to elaborate the impact of the protein on virulence related to sRNAs in S. aureus. Besides, whether sRNA can function by directly binding to proteins instead of mRNAs will be addressed. The project should deepen and enrich our understanding of the regulation of sRNA in bacteria, and provide new ideas for the research on the regulation of virulence factors in S. aureus.

细菌非编码小RNA（sRNA）在细菌生理调节及致病菌毒性调控中具有重要的作用，近年来金黄色葡萄球菌中sRNA对致病性调控的机制研究已成为研究热点。sRNA通过与mRNA直接相互作用进而调其稳定性或者翻译起始的机制已被研究得较为透彻，然而依靠蛋白质分子参与的细菌sRNA合成和调控过程仍少有报道。我们通过前期探索，确立了以链霉亲和素RNA适配体为Tag来进行RNA-蛋白质pull down的实验手段，并成功利用这种方法对金黄色葡萄球菌中重要sRNA的结合蛋白进行了搜寻和鉴定。本项目拟在上述基础上，系统鉴定并验证金黄色葡萄球菌中潜在的重要sRNA结合蛋白，深入研究这些蛋白对于sRNA稳定性影响及在其调控网络的作用，阐明RNA结合蛋白在sRNA致病性调控中的功能与地位，进而完善金黄色葡萄球菌sRNA的分子调控网络，以期为金黄色葡萄球菌的防治提供新的靶标与切入点。

金黄色葡萄球菌是重要的条件致病菌，可引起多种感染。金葡菌的致病性受到包括非编码小RNA（Small RNA,sRNA）在内的多种调控因子的调控，我们预测，金葡菌sRNA的调控模式不仅局限于sRNA与靶RNA的相互作用，可能有一些蛋白质参与其中。但是由于技术的限制对金黄色葡萄球菌中sRNA相关的蛋白质的研究进展缓慢。本项目成功建立了利用tRNA融合RNA适配体（简称tRSA）进行sRNA 蛋白质pull-down 的实验体系，选取了金黄色葡萄球菌中重要的sRNA——RNAIII，对其结合蛋白进行钓取。实验发现tRSA标记的RNA能够较好被链霉亲和素磁珠捕获，用这个体系成功钓取了81个能够结合RNAIII的候选蛋白质。进一步通过蛋白质表达、凝胶阻滞分析验证了这些候选蛋白与RNAIII的结合能力。选取的9个蛋白质中，RNase III对RNAIII具有降解活性，7个蛋白（CshA、RNase J2、Era、Hu、WalR、Pyk、FtsZ）可以结合RNAIII，PfkA没有检测出结合能力。同时选取了两个pull-down未鉴定出的，但属于RNA降解体的蛋白，发现它们并不能够直接结合RNAIII。项目成果提示我们金黄色葡萄球菌中可能有很多蛋白质结合RNAIII，并有可能参与它的调控过程；本项目所建立的tRSA的体系能够很好的运用于金黄色葡萄球菌sRNA结合蛋白的pull-down实验，能够成功鉴定出部分RNAIII的结合蛋白质。深入研究这些蛋白质对于sRNA调控以及金黄色葡萄球菌致病性调控的作用，能够深化我们对细菌sRNA调控机制和复杂网络的认识，并为金黄色葡萄球菌的防治提供新的治疗思路与药物靶标。