极端微生物来源四氢嘧啶生物合成通路模块化调控研究

运用合成生物学的方法，对微生物进行改造，提高微生物的抗逆能力，不仅具有重大理论研究意义，同时具有很强的应用价值。四氢嘧啶合成途径是极端微生物抗逆机制的一个典范，借鉴此模式，在微生物中重构四氢嘧啶合成通路，可望提高普通微生物，尤其是一些重要工业微生物的抗逆性。由于四氢嘧啶在许多极端微生物中合成途径较清楚，存在大量可用的合成代谢元件和模块。本项目借助这些模块化元件，在重要微生物大肠杆菌中对四氢嘧啶合成通路进行组装、调试和优化，最终实现大肠杆菌抗逆性能的提高。本项目的成功将为全面改造重要工业微生物提供一条新的途径。同时，本项目的实施也将为推动合成生物学的发展提供必要的元件和技术准备。

四氢嘧啶作为相容性溶质在帮助微生物适应高渗透压环境的过程中发挥了重要作用。越来越多的研究表明，四氢嘧啶作为一种高效的保护剂，在食品、化妆品以及医药等领域都展现出了广阔的应用前景。同时，伴随合成生物学的发展，四氢嘧啶的合成对于提高重要工业微生物如大肠杆菌自身的抗逆性也具有重要的意义。.本项目通过筛选不同来源的四氢嘧啶合成基因簇，并在在大肠杆菌中对这些四氢嘧啶合成基因簇进行了重构、组装和表达。通过比较分析不同基因簇在大肠杆菌中的表达以及四氢嘧啶合成水平的分析，发现来源于嗜盐菌Halomonas elongate 的四氢嘧啶合成基因簇具有较强合成四氢嘧啶的能力。通过添加天冬氨酸和甘油作为前体物质，在大肠杆菌中实现了四氢嘧啶高水平的合成。同时研究表明，伴随四氢嘧啶在大肠杆菌中的大量合成，四氢嘧啶可大量外泌到胞外，这为进一步分离和纯化四氢嘧啶提供了便利。在低密度条件下（5 OD/mL）,在最优条件下，胞外四氢嘧啶浓度可高达2.67mg/mL. 在高密度条件下（20 OD/mL），最高产量可达25.1g/L。与此同时，每克干菌可产生大约4g左右的四氢嘧啶，为目前文献报道最高值。而且研究表明，生产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌株可重复使用最少三轮以上，每一轮的效率能保持80%左右，总产量可高达每升菌体生产63.4g四氢嘧啶。.同时，本项目尝试利用不同启动子启动四氢嘧啶合成的大肠杆菌菌株。获得了一系列四氢嘧啶合成水平不同的大肠杆菌菌株，为进一步筛选抗逆性增强的大肠杆菌菌株提供了选择空间。另外，非常重要的是，将实验室制备的四氢嘧啶添加进入培养基中，可显著提高大肠杆菌的抗渗透压能力。