链病毒定(Streptovirudin)结构单元—二氢尿嘧啶生物合成机制的研究

Two uridine antibiotics tunicamycin and streptovirudin are produced from Streptomyces sp. fd1-xmd. Research has indicated that tunicamycin has distinct antibacterial biological activity but is also toxic to eukaryotic cells, which limits its further clinical application. In comparison, streptovirudin retains antibacterial biological activity with reduced toxicity to eukaryotic cells. Interestingly, the chemical structures of tunicamycin and streptovirudin are very similar with subtle difference that parts of streptovirudin contain dihydrouracil building block. Till so far, the detailed biosynthetic mechanism for dihydrouracil remains elusive. Our preliminary studies found that streptovirudin biosynthetic gene cluster contained a characteristic F420-dependent oxidoreductase Stv2 and tetrahydropyrimidine hydroxylase Stv1, which was absent in tunicamycin biosynthetic gene cluster. We speculated that these two enzymes might play critical roles in the biosynthesis of dihydrouracil motif. This project intends to investigate the catalytic functions of these two enzymes in biosynthetic pathway by identifying substrates of the two enzymes through gene knockout tools, followed by in vitro biochemical characterization. Our studies will help decipher the mechanism of dihydrouracil motif biosynthesis at molecular levels, therefore laying a foundation for further synthetic biology modification of related uridine antibiotics.

链霉菌fd1-xmd能产生衣霉素和链病毒定两种尿苷类抗生素；衣霉素拥有显著的抗细菌生物活性，但对真核细胞亦有强烈毒性，这限制了其在临床上的进一步应用，链病毒定则在保留抗细菌生物活性的同时降低了对真核细胞的毒性。衣霉素与链病毒定化学结构非常相似，细微差别在于部分链病毒定组分含有二氢尿嘧啶结构单元，迄今为止，该结构单元生物合成的分子机理一直悬而未决。本项目通过生物信息学分析发现，链病毒定生物合成基因簇和衣霉素相比多了一个注释为F420依赖的氧化还原酶Stv2和一个四氢嘧啶羟化酶Stv1，推测它们负责二氢尿嘧啶结构单元的生物合成，但是在合成途径中两个酶如何发挥功能，催化哪个底物尚不清楚。本项目拟通过基因敲除累积中间产物获得两个酶的底物，再利用体外生化实验解析两个酶的催化功能，从分子水平上解析二氢尿嘧啶结构单元的生物合成机制，为衣霉素类抗生素的合成生物学改造奠定基础。

链霉菌fd1-xmd能产生衣霉素和链病毒定两种尿苷类抗生素；衣霉素拥有显著的抗细菌生物活性，但对真核细胞亦有强烈毒性，这限制了其在临床上的进一步应用，链病毒定则在保留抗细菌生物活性的同时降低了对真核细胞的毒性。衣霉素与链病毒定化学结构非常相似，细微差别在于部分链病毒定组分含有二氢尿嘧啶结构单元，迄今为止，该结构单元生物合成的分子机理一直悬而未决。本项目通过生物信息学分析发现，链病毒定生物合成基因簇和衣霉素相比多了一个注释为F420依赖的氧化还原酶Stv2和一个四氢嘧啶羟化酶Stv1，推测它们负责二氢尿嘧啶结构单元的生物合成。随后，通过基因敲除实验初步断定Stv1和Stv2负责还原尿嘧啶形成链病毒定二氢尿嘧啶结构单元。然而，stv1和stv2突变株的发酵液中并没有积累明显的中间产物，因此无法直接获得两个酶的底物。对Stv1和Stv2进行蛋白功能分析后，推测Stv1的底物为不饱和长链脂肪烃，Stv2的底物为含尿嘧啶结构的化合物。接着，对Stv1和Stv2进行异源表达和体外纯化后，以推测的底物对Stv1和Stv2进行体外活性测试。遗憾的是，催化反应均无新峰产生，表明推测底物不正确或者是需要二者共同作用。为了验证猜测，将基因stv1和stv2分别以及同时进行基因回补实验，结果表明只有Stv1和Stv2的共同作用才能产生链病毒定。因此，通过基因敲除和基因回补实验，初步阐明了stv1和stv2的体内功能，揭示了链病毒定二氢尿嘧啶结构的生物合成需要Stv1和Stv2的共同作用的机制，而Stv1和Stv2的体外功能有待进一步的研究。目前的研究工作将有助于在分子水平上解析二氢尿嘧啶结构单元的生物合成机制，从而为相关尿苷类抗生素的进一步合成生物学改造奠定基础。