Iars 调控斑马鱼血管发育的分子机制研究

The canonical functions of Aminoacyl-tRNA synthetases (AARSs) are indispensable for protein synthesis but some AARSs possess additional biological functions related to immune responses and vascular development. In a recent genetic screen, we identified a zebrafish mutant that presented the disorganized vessels with abnormal branching of the established intersegmental vessels (ISVs) as well as aberrant patterning of the hindbrain capillaries after 48 hours post fertilization （hpf）. The gene responsible for this mutant encodes Threonyl-tRNA synthetase (Iars) with a missense mutation. We found Iars was associated with VEGF signal. Furthermore, our preliminary data indicate part of Iars protein was located in nucleus. Therefore, we raise the hypothesis that Iars is as a VEGFA transcription factor to regulate vascular development. To verify our hypothesis, this project is divided into four parts: 1) Research about the noncanonical function of Iars influencing vascular development; 2) Research about Iars regulating vascular development via VEGF signal; 3）The mechanism of Iars protein imported into nucleus; 4) Identification of the Iars-associated genomic DNA elements.

氨基酰tRNA 转运合成酶（AARSs）的经典功能是负责蛋白质的合成，然而有些AARSs具有免疫和血管发育等额外生物学功能。在最近的一次遗传筛选中，我们鉴定出一种斑马鱼突变体：出生后48h血管开始发生紊乱，其节肢血管（ISVs）增多，后脑微血管异常。我们通过染色体步移方法鉴定出该表型是由编码异亮氨酰tRNA 转运合成酶基因（Iars）的一个错义突变所导致。我们发现Iars与VEGF信号相关。此外，前期的工作指出部分Iars蛋白在细胞核内。由此，我们提出假设：Iars是作为VEGFA的转录因子来调控血管发育。为证实该假说，我们从以下四个方面展开工作：1）Iars的非经典生物功能影响血管发育的研究；2）Iars介导VEGF信号来调控血管生成的研究；3）Iars蛋白入核机制研究；4) Iars在染色质DNA位点的克隆。

异亮氨酰tRNA 转运合成酶（Iars）的经典功能是催化异亮氨酸和tRNA形成异亮氨酰tRNA复合物，进而将异亮氨基酸转运到核糖体上合成肽链。我们在斑马鱼高通量遗传筛选(ENU)中鉴定出一种斑马鱼突变体：至 48hpf 后血管出芽开始增多及后脑血管异常。经定位克隆鉴定，该表型是由于Iars基因一个错义突变导致。有研究表明，丝氨酰tRNA转运合成酶作为血管内皮生长因子A（VEGF-A）的转录因子抑制血管生成，谷氨酰-脯氨酰tRNA转运合成酶通过在翻译水平上沉默VEGF-A来抑制血管的生成。同时，我们发现Iars与VEGF信号也存在相关性，为了探究Iars调控血管生成的分子机理，我们开展了如下4个方面的研究：1）Iars的非经典生物功能影响血管发育。利用CRISPR/Cas9技术， 经测序筛选后我们获得了两种突变类型，分别为 5 个碱基（IarsΔ5）和 11 碱基（IarsΔ11）敲除。 Iars cas9 突变体具节肢血管增多表型，与 Iars 突变体血管表型一致。该结果表明 Iars 功能缺失导致斑马鱼节肢血管增多，提示Iars 可作为抗肿瘤和组织器官伤口修复有效的可利用靶点；2）Iars介导VEGF信号来调控血管生成。我们利用Vegf 信号抑制剂 SU5416 处理和注射 Vegf 信号配体 vegfaa Morpholino 来抑制 Vegfaa 信号，均表明 Iars 通过抑制 vegfaa 的表达来调控血管生成，提示 Iars 为新的转录 因子参与调控 Vegf 信号表达；3）Iars蛋白入核机制。首先，我们开展了HUVEC 细胞核质分离实验。结果显示 Iars 蛋白少部分存在细胞核中。然后，我们通过N端保守序列克隆、转染、荧光成像等方法发现转染 GFP-NLS(IARS)质粒的细胞核内具绿色荧光，只转染 GFP 质粒的细胞仅细胞质中具绿色荧光。该研究结果表明 IARS 蛋白 N 端前 13 个保守氨基酸序列为核定位信号。 4) Iars在染色质DNA位点的克隆。染色质免疫共沉淀实验（ChIP）结果显示，样品组未能很好地结合于10对Vegfa启动子序列上，提示Iars蛋白在染色质的附着位点不在vegfa的启动子上，可能在其他基因的启动子区域。这些研究结果为揭示血管生成的分子机制及临床医学中抑制肿瘤血管的增生提供科学依据。