斑马鱼心脏发育阶段特异表达基因FhlA调控心脏腔室发育的分子机制

Studies have shown that the expression of the human FHL1 gene was related to cardiovascular disease. But the function of FHL1 in heart development is not clear. The results of applicant preliminary study showed that the FhlA, the highly homologous gene of the human FHL1, was specific expressed in the zebrafish heart from 22 somite stage and regulated of the developmental cardiac chamber size through negative regulation of cardiac precursor cell proliferation. And the retinoic acid signaling pathway may be related to the regulation of the FhlA in the heart development. The applicant intends to study the molecular mechanism of FhlA gene regulation in cardiomyocyte proliferation and explore FhlA gene function in the retinoic acid signaling pathway that regulate the cardiac chamber size, by establishing FhlA gene knockout and transgenic experimental model. On the basis of the the preliminary identification of the interaction between FhlA and PP2A catalytic subunit, a retinoic acid receptor regulatory protein, the applicant intends to explore molecular mechanism of Synergistic efficacy of the interaction between FhlA and PP2Ac in the retinoic acid signal regulation of the heart chamber size and myocardial cell proliferation. The research is of great significance for FHL1 function of the human heart development.

前人研究表明：人类FHL1基因突变导致心脏疾病的发生，但其发病机制未知。申请者前期研究发现： FHL1的斑马鱼同源基因FhlA在心脏前体细胞中特异表达，该基因通过负调控心脏前体细胞的数目控制心脏腔室大小的发育，其对心脏发育的调控可能与视黄酸信号通路有关。为了进一步研究fhlA调控心脏腔室大小的分子机制，申请者拟通过FhlA基因敲除和转基因斑马鱼模型，研究FhlA基因调控心肌细胞增殖的机理，探讨FhlA基因是否通过视黄酸信号通路调控心脏腔室大小的发育过程；基于申请人鉴定的FhlA与视黄酸受体调控蛋白PP2A有相互作用的基础上，研究FhlA和PP2Ac两者通过视黄酸信号相互作用协同调控心脏腔室的大小及调控心肌细胞增殖的的分子机理。该研究对揭示FHL1导致人类心脏疾病发生的机制具有重要意义。

我们前期研究发现： FHL1的斑马鱼同源基因FhlA在心脏前体细胞中特异表达，该基因通过负调控心脏前体细胞的数目控制心脏腔室大小的发育，其对心脏发育的调控可能与视黄酸信号通路有关。本研究针对Fhl1A(也称FHLa，位于14号染色体)基因组3号外显子序列进行CRISPR/Case9方法基因敲除得到缺失120bp（45号家系）、49bp（15号家系）和 127bp（93号家系）三个突变品系，利用127bp（93号家系）进行表型，致死性与原位杂交分析，分析结果表明：与野生型对照相比，敲除纯合子不致死，心房增大的比例不明显，Myl7,vmhc,amhc等心脏发育标志基因没有明显变化。统计分析，约30%发育3天幼鱼的心脏环化出现异常，我们进一步利用瓣膜发育标志基因进行原位杂交分析，在已完成的结果显示：除vesican和bmp4 的表达下调外，has2和 notch1b 等其他标志基因表达没有明显变化，以上结果与我们先前的MO敲低的结果不一致。导致不一致的原因可能与人类fhl1基因在斑马鱼10染色体上另外一个拷贝Fhl1b(genebank中2016年底公开）有关,针对Fhl1b基因组3号外显子序列进行CRISPR/Case9方法基因敲除得到缺失71bp的突变家系，该家系纯合子也没有突变表型。我们进一步通过western Blot分析，Fhl1A和Fhl1b可以功能互补。目前利用杂交得到双基因杂合子，正在是筛选双基因突变纯合子，补充相关数据。