中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白免疫原性研究

目前蜂病毒病对养蜂业的发展和农业生态平衡的危害日趋严重，尤其是CSBD每次爆发，几乎对我国中蜂业造成毁灭性的打击，但从免疫学角度对CSBV的防治进行研究，至今还未见相关报道。为此本研究拟通过对我国CSBV分子流行病学调查，分析我国CSBV遗传进化背景，揭示其分子流行病学本底与流行规律等。在此基础上，选择优势流行毒株，分析其分子生物特性，推测可能的结构蛋白基因序列，并利用杆状病毒表达系统，分别对推测的结构蛋白基因进行表达，对优势流行毒株进行分离、纯化和灭活，制备灭活疫苗作为对照，同时参照果蝇、蜜蜂免疫研究相关报道和利用生物学软件确定蜜蜂抗病毒感染免疫的相关检测指标。在此基础上，通过小鼠免疫实验和蜜蜂免疫实验对4种结构免疫原性进行综合评价分析，为CSBV标准阳性血清制备和疫苗研究奠定基础。

本研究于2010年受到国家自然基金资助开始启动，目前已经按合同书预定的内容完成了相关研究。在本研究中，本课题组完成了辽宁株（CSBV-LN）全基因组进行分子克隆、序列测定、分子生物学特性分析及其结构蛋白预测和鉴定，获得CSBV-LN全基因组序列长为8863个核苷酸，并提交GenBank（登录号为HM237361.1）。氨基酸序列分析表明CSBV-LN发生了变异，与CSBV-GZ 和SBV-UK 相比，在710-719和727-729 发生了氨基酸缺失，但与SBV-UK 相比，CSBV在2125-2131位增加7个氨基酸，在2144-2149位，发生了氨基酸缺失。同时我们在CSBV-LN鉴定出3个解螺旋酶保守区，8个RdRp保守区。根据系统分析进化分析，推测出CSBV有着类似DWV的结构蛋白序列5’-VP2 VP4 VP1 VP3-3’。基于此，根据PAGE蛋白条带的大小，利用NetPicoRNA软件预测结构蛋白的裂解位点。在此基础上，对纯化后的CSBV进行SDS-PAGE，经SDS-PAGE分离到的4个蛋白进行质谱分析，结果鉴定出VP1、VP3和VP0三个结构蛋白。将预测的VP2结构蛋白和鉴定出的VP1和VP3结构蛋白分别进行了杆状病毒表达载体构建，经透射电镜观和Western-blotting，证明VP1、VP2和VP3结构蛋白基因在重组杆状病毒获得表达。表达蛋白经小鼠免疫试验后，表明VP1免疫组抗体水平与淋巴细胞增殖指数与VP2和VP3免疫组相比差异显著。同时我们将表达的蛋白用于饲喂蜜蜂，对免疫信号进行了检测，但各组之间差异不显著，没有获得预期的实验数据。在此基础上，本课题组以CSBV VP1为靶基因，对CSBV进行分子流行病学调查，结果表明，来源于不同地域、不同宿主的毒株VP1存在着氨基酸缺失现象，并发生了变异，说明CSBV（或SBV）具有宿主特异性和地区差异性，但通过生物信息学软件分析表明，所有分离株的VP1结构蛋白的抗原性和二级结构高度相似。 . 在完成上述研究内容同时,根据研究和生产实际需要完成了CSBV.普通RT-PCR检测方法建立，TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法建立，LAMP检测方法建立，兔抗CSBV多克隆抗体和鸡抗CSBV卵黄抗体的制备，均已用于研究和生产中