多肽连接酶Butelase-1的糖基化位点及其功能初探

The development of new engineered polypeptide ligases is of great importance in the chemical synthesis of proteins and peptides. Butelase-1 is a plant-derived asparaginyl endopeptidase (AEP) with ligase activity, which has good application prospects in polypeptide ligation and protein modification. Currently, Butelase-1 is mainly obtained by natural extraction with high cost and low yield, which seriously hampers its widespread application. Our previous study of Butelase-1 found that it was highly conserved among different species and had potential glycosylation sites. In this project, the effects of potential glycosylation sites on the in vivo function of Butelase-1 were studied by using transgenic techniques and site-directed mutagenesis. And yeast expression system was used to study the effect of potential glycosylation sites of Butelase-1 on its expression, maturation and purification. Based on this, the substrate adaptability of wild-type and mutant Butelase-1 was tested by chemical synthesis of various different substrates. Through this project, we aim to reveal the function of its potential glycosylation sites and to establish a stable biological expression system of Butelase-1 through bioengineering to greatly improve its exogenous expression activity.

开发新型工程改造的多肽连接酶在蛋白质与多肽化学合成方面具有重要意义。Butelase-1为植物来源具有连接酶活性的天冬酰胺内肽酶，在多肽连接和蛋白质修饰中具有很好的应用前景。目前，Butelase-1主要依靠天然提取，成本高，产率低，严重制约了其广泛应用。分析发现，Butelase-1在不同物种中非常保守，且具有潜在的糖基化位点。本项目拟利用转基因技术及定点突变技术研究Butelase-1潜在糖基化位点对其功能的影响，并利用酵母表达系统，研究糖基化修饰对Butelase-1表达成熟及纯化的影响。基于此对Butelase-1进行工程改造，并通过化学生物学手段合成多种不同底物，检测野生型及工程改造型Butelase-1的底物适应性。通过本项目的开展，旨在揭示其潜在糖基化位点的作用机制，并通过生物工程改造建立Butelase-1稳定的生物表达系统，大幅提高其外源表达活性。

Butelase 1是近年来发现的一种多肽连接酶，由于其特异性识别序列短，连接效率高，成为具有应用潜力的一类多肽连接酶。Butelase 1具有植物界保守的糖基化位点，而且与其在动物中同源蛋白的糖基化位点不同，表明这些位点可能存在功能上的差异。目前, butelase 1的异源表达相对比较困难，植物特有的糖基化位点是否对butelase 1的异源表达及功能有影响还不得而知。本项目基于不同物种来源butelase 1同源蛋白的多序列比对，我们系统的分析了该家族成员的糖基化位点分布，发现butelase 1存在五个可能的糖基化位点，而且他们的保守性不尽相同；利用PCR技术分别对这些位点进行点突变，构建野生型及相应突变体的蛋白表达载体和植物转基因载体。大肠杆菌系统表达结果显示大部分情况下，该蛋白表达主要集中于包涵体中，突变体亦是如此。GFP融合蛋白植物叶片瞬时表达结果显示，这些蛋白均定位于内质网结构上，突变体也定位于内质网，但定位的pattern稍具差异。综合结果推测糖基化位点可能对其功能（定位、成熟和活性发挥）没有影响或影响不大。未来可进一步揭示该家族蛋白糖基化位点对其内质网上的分布的影响，为从广义层面上理解糖基化的功能，以及butelase 1的改造设计上提供一定的理论基础。另外，我们基于原核细胞膜磷脂结合肽，构建穿膜肽递送系统，未来计划利用所构建的系统递送butelase 1蛋白，对胞内的蛋白或多肽进行相应的标记或连接实验。