泛Raf/Ret激酶多靶点抗肿瘤药物设计、合成及生物活性研究

Ras/Raf/MAPK, an important signal transduction pathway in regulation of cell growth and proliferation, plays an important role in the occurrence and development of tumor and is by far one of the most active signal pathways. At present, drugs that target the Raf kinase are particularly eye-catching. We have obtained a novel lead compound L2-1 in the previous work. L2-1 exhibits very strong inhibitory activity toward A-Raf (IC50=0.97nM), wild-type B-Raf (IC50=0.99nM), B-RafV600E (IC50=1.91nM) and C-Raf (IC50=0.51nM). Moreover, it is also a desirable inhibitor against Ret kinase (IC50=5.424nM) on the upstream signal pathway of Raf, providing a possible way to overcome the resistance of Raf kinase. On the basis of the previous work, this project aims to improve the activity and drug-like properties of the lead by optimizing its structure so that we can obtain candidate compounds which can be used in clinical research. Simultaneously, drug resistance mechanism of Ret-Raf pathway inhibitors will be elucidated, which will lay a foundation for the research and development of Ret/Raf dual antitumor drugs.

Ras/Raf/MAPK信号通路是迄今为止研究最为活跃的通路之一，该通路参与调节细胞的生长与增殖，在肿瘤发生、发展中起着重要作用，目前针对Raf激酶的靶向药物研究尤为引人瞩目。我们前期工作中得到了一类结构新颖的先导化合物L2-1，其对A-Raf(IC50=0.97nM)，wild-type B-Raf（IC50=0.99nM）,B-RafV600E（IC50=1.91nM）和C-Raf（IC50=0.51nM）均有很强的抑制活性，同时对该通路上游的Ret激酶（IC50=5.424nM）也具有很好的抑制活性，为克服Raf激酶的耐药性提供了可能的途径。本项目拟在前期工作的基础上，对先导物L2-1的结构进行优化，改善先导物的活性和类药性，以期获得可用于临床研究的候选化合物。同时明确该类化合物作为靶向Ret-Raf通路抑制剂的抗耐药机制，为Ret/Raf多靶标抗肿瘤药物的研发奠定基础。

RTK-Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路与肿瘤的发生密切相关。IIB型B-RafV600E选择性抑制剂Vemurafenib在临床上用于治疗黑色素瘤，但用药过程中常出现获得性耐药。研究表明，IIA型的泛Raf抑制剂可有效避免因BRafWT或CRaf异常激活导致的BRafV600E抑制剂的获得性耐药。Ret激酶位于Ras-Raf-MEK-ERK通路上游，也受到了广泛的关注。为了克服BRafV600E抑制剂的耐药性，本项目拟开发泛Raf/Ret多靶点的新型抗肿瘤药物。.本项目以化合物II-01为先导物，在分析其与B-Raf及Ret激酶结合模式的基础上，运用FBDD和合理药物设计等方法，设计并合成了基于嘌呤、吡咯并嘧啶及氨基嘧啶结构的四类，共122个化合物，结构经MS、1H-NMR及13C-NMR确证。测试了所有化合物对BRafV600E的抑制活性，挑选抑制活性好的化合物测试其对ARaf、BRafWT、CRaf及Ret的抑制活性。并选取对泛Raf/Ret激酶抑制活性较好化合物测试其对多种肿瘤细胞系（BRafV600E、BRafWT及Ret异常高表达）的抗增殖活性；选取化合物III-08及IV-39测试其对NCI细胞库中57株肿瘤细胞的抗增殖活性，结果表明，化合物IV-39对所有细胞株的GI50值均为个位μM级。在研究6个目标化合物抗人黑色素瘤A375和SK-MEL-2肿瘤细胞增殖的作用机制的基础上，测试化合物IV-01、IV-14及IV-41对人肝微粒体的体外代谢稳定性，测试化合物IV-14、IV-41及V-15在大鼠体内的药物代谢动力学性质。经系统的生物学评价，发现了一类新型的泛Raf/Ret多靶点抑制剂，其中候选化合物IV-41对ARaf、BRafWT、BRafV600E、CRaf及Ret的IC50分别为25.3 nM、29.7 nM、12.2 nM、13.3 nM及16.1 nM；对人黑色素瘤细胞株A375、SK-MEL-2及人甲状腺癌细胞株TT的IC50分别为1.02 μM、0.36 μM及2.60 μM。肝微粒体稳定性及体内药代动力学实验结果表明，其体内半衰期达4.9 h，口服生物利用度为44.0 %，具有良好的成药性及应用前景。.本项目发现了一系列结构新颖的泛Raf/Ret多靶点抑制剂，具有自主知识产权，后续我们将对其做进一步的体内活性探究。