模拟生理环境下碱性磷酸酶的折叠、稳定性及分形催化动力学研究

Alkaline phosphatase is a homodimeric metalloenzyme that plays a very important role in the phosphate metabolism in living organisms. However, their previous studies are carried out in dilute solution, but the intracellular environment is, in fact, highly crowded, so that experimental data are often obtained in dilute solution that do not reflect in vivo condition. Therefore, in this project, a mimic real cell condition will be constructed by adding macromolecular crowding agents and osmolytes. Through the combination of the experimental research and simulate computation, we research the alkaline phosphatase folding process, stability and catalytic kinetic mechanism. In this study: (1) We investigate the effects of different crowed environments on the folding (unfolding an refolding process) and self-association of alkaline phosphatase to reveal the changes of enzymatic activity and conformation. (2) Effect of molecular crowding on alkaline phosphatase stability under denaturing experimental conditions are investigated directly with circular dichroism spectroscopy and fluorescence spectroscopy. (3) Experimentally, we investigate the influence of isozyme and reaction type on the enzyme kinetics under crowded conditions, and fractal modified Michaelis-Menten equation will be used to fit enzymatic catalytic kinetics. Theoretically, Monte Carlo simulations are also applied to this kind of study. Combining with experimental analysis and computational simulation, we try to bring to light exact enzyme kinetic equation. The research findings will be beneficial for understanding folding process and physiological function of alkaline phosphatase in the body. The methodologies in this project can open an avenue for the mechanism research of other important enzymes.

碱性磷酸酶是一种同源二聚体金属酶，在生物体的磷代谢过程中起着非常重要的作用。然而以往对其研究都是在稀溶液中进行的，实际上细胞内环境是拥挤的，故不能正确的描述其功能性质。基于此，本项目通过添加大分子拥挤试剂和渗透剂来构建与真实细胞相似的拥挤环境，运用实验研究并辅以模拟计算的方法来研究碱性磷酸酶的折叠过程、稳定性以及催化动力学机制。研究中(1)考察不同拥挤环境对其去折叠、重折叠途径以及同聚化过程的影响，揭示酶活性与构象的变化情况；(2)利用圆二色、荧光等手段对其在变性过程中的稳定性进行分析；(3)实验上考察同工酶、反应类型对拥挤环境中酶动力学的影响，且运用分形修正的米氏方程对酶催化动力学进行拟合，理论上用蒙特卡罗方法进行模拟，综合两方面结果，揭示出准确的酶催化动力学规律。研究成果可更好地理解碱性磷酸酶在体内的折叠过程与生理功能，也可为人体内其他重要酶蛋白的调控及机理研究提供理论指导和方法借鉴。

细胞中成千上万种生物分子以不同的浓度发挥着各自的生理作用，但是体外研究中人们常常忽略细胞内的拥挤环境。因此，通过添加拥挤试剂来模拟生理环境，进而考察其对蛋白质等生物分子的行为具有极其重要的作用。本项目考察了拥挤环境对蛋白质的折叠、稳定性、多肽共组装以及蛋白质-小分子互作等行为的影响。具体研究中：（1）应用多种光谱技术研究分子拥挤环境对碱性磷酸酶去折叠途径的影响，表明拥挤试剂的加入会增加酶的活性，对N→I过程中酶结构的稳定性起到保护作用。（2）研究分子拥挤环境对碱性磷酸酶热稳定性的影响，发现在45 °C至60 °C区间内拥挤环境会对酶起到保护作用，且复性后拥挤环境中酶活性恢复得更好，同时酶的变性机制也由三态模型变为二态模型。（3）采用多种分析手段研究稀溶液和大分子拥挤环境中鱼精蛋白与Fmoc-FF的共组装行为，发现拥挤环境中肽分子与蛋白共组装体所形成的纤维分散性更好，机械性能更强，但螺旋度降低、直径变小。（4）研究模拟生理环境中人血清白蛋白与三氯卡班的相互作用机制，表明三氯卡班能够在人血清白蛋白亚结构域IIA的疏水腔中通过疏水相互作用力以1:1的方式相结合，并导致蛋白发生静态猝灭。此外，它们之间的互作也会使蛋白的空间构象发生改变。最后，分子对接和分子动力学模拟进一步验证两者的结合机制。该项目研究成果可更好地理解蛋白在体内的行为，也可为人体内其他蛋白的调控及机理研究提供理论指导和方法借鉴。. 研究成果共发表SCI论文4篇，培养博士生1人，硕士生3人，参加国内外学术交流及会议3次。