VanRS双组分系统在VanA型万古霉素耐药性肠球菌中的调控机制研究

Vancomycin is considered to be the last line of defense for therapying infections due to gram positive bacteria. Infections caused by Vancomycin-Resistant Enterococci are reported in an increasing number and the therapeutic measure is limited. Vancomycin resistance attributed to expression of the resistance genes of the vanAHX clusters is regulated by the VanRS two-component regulatory systems.The VanRS two-component signal transduction system in VanA-Type Vancomycin-Resistant Enterococci V309 were studied in early stage. To our surprise, the vanAHX clusters in V309 can be expressed without inducement of vancomycin. This phenomenon indicated that the activation of VanRS two-component regulatory systems of V309 maybe changed to some extent, or the VanRS systems could "cross-talk" with other two-component regulatory systems in cell. So we want to further analyse the VanRS system and the resistance regulatory mechanism of VRE, to clarify the expression of VanR and VanS protein and it's function. Our study can provide theoretical basis for restraining production of VanA enzyme and resolving vancomycin-resistant problem.

糖肽类抗生素万古霉素通常作为治疗G+菌感染的最后一道防线，而近年来万古霉素耐药性肠球菌的感染日趋严重，成为临床治疗的难点。万古霉素耐药性源于VanRS双组分严谨型调控系统对胞外的抗生素做出应答而激活vanAHX结构基因簇的表达。在前期研究中我们发现，VanA型VRE菌株V309中的VanRS双组分系统可被万古霉素诱导，发生自我磷酸化并激活vanAHX的表达；而出乎意料的是，在无万古霉素诱导时vanA基因簇同样具有高水平的表达活性，这表明V309中的VanRS双组分系统可能在活性上发生了改变，或者存在VanRS双组分系统的交叉调节。本研究拟在前期研究基础上，深入分析VRE的耐药调控机制。通过对VanR、VanS的表达情况、功能及相互作用的研究，阐明VanRS双组分系统的功能及应答机制，为进一步从分子水平阻断VanA酶的产生，有效解决VRE耐药问题提供理论依据。

糖肽类抗生素万古霉素通常作为治疗G+菌感染的最后一道防线，而近年来万古霉素耐药性肠球菌的感染日趋严重，成为临床治疗的难点。万古霉素耐药性源于VanRS双组分严谨型调控系统对胞外的抗生素做出应答而激活vanAHX结构基因簇的表达。在前期研究中我们发现，VanA型VRE菌株V309在无万古霉素诱导时vanA基因簇同样能够被激活表达。本研究通过对V309菌株菌体蛋白的比较蛋白质组学研究进一步确认了无万古霉素压力下V309菌体存在VanA、VanX的表达。通过对V309菌体的全基因组测序，我们分析了菌体中的其它双组分系统，我们发现在V309菌体中存在一个LuxS/AI2依赖的QS系统，并确认其在菌体代谢调控中发挥重要作用，但遗憾的是我们未发现菌体中可能与VanRS双组分调控系统存在交叉调节的其它双组分基因调控系统。我们进一步构建V309ΔvanR、V309ΔvanS基因缺失突变株，通过对突变株在万古霉素诱导下的比较蛋白质组学研究，分析VanR及VanS蛋白在V309菌体耐药基因表达中的作用，发现V309ΔvanR突变株在万古霉素诱导前后均没有出现耐药蛋白VanA的表达，这表明VanR在菌体中万古霉素耐药基因的表达中起决定性作用，VanR缺失后菌体中万古霉素耐药基因无法表达，而V309ΔvanS突变株在万古霉素诱导前后均存在耐药蛋白VanA的表达，且表达量与未经万古霉素诱导的野生株处于同一水平，表明VanS在菌体对万古霉素的耐药应答过程中起决定性作用，缺失VanS后菌体无法对万古霉素做出有效应答；同时，由于在缺失突变体的比较蛋白质组学鉴定结果中未鉴定出其它万古霉素耐药相关双组分系统差异蛋白，因此排除了由交叉调节或旁路调节导致的耐药基因诱导表达通路。我们进一步研究了V309菌体中VanR、VanS蛋白的相互作用，通过凝胶阻滞实验证实了V309中的VanR蛋白直接受VanS蛋白的调控。由此，我们分析认为在V309菌体中是由于自然状态下存在的小分子磷酸供体-乙酰磷酸，使VanR蛋白持续发生一定程度的磷酸化，从而在无万古霉素诱导时表达少量耐药蛋白。此外，我们研发了用于检测VanB基因的LAMP试剂盒及其专用引物，并申请了专利。在该资金的资助下发表文章5篇，其中SCI收录4篇，均标注受到本基金资助。培养博士生2名，硕士生1名，均已按期毕业。