柑橘缺硼响应microRNAs分离及其生理功能鉴定

我国柑橘产区常出现不同程度的缺硼现象，很有必要研究缺硼胁迫下柑橘分子生理。有鉴于此，本项目拟以对缺硼敏感的酸柚和不敏感的椪柑为试验材料，率先对柑橘缺硼响应microRNAs（miRNAs）进行分离，挖掘出与柑橘缺硼相关的关键miRNAs及其靶基因，并利用模式植物拟南芥对分离得到的关键miRNAs进行功能鉴定。旨在揭示miRNAs在柑橘缺硼胁迫下的作用，从转录后水平上阐明柑橘耐缺硼的分子机制，最终提高柑橘的耐缺硼能力，为实现柑橘高产优质栽培提供科学依据。

率先通过沙培研究了(a)缺硼胁迫下柑橘根叶miRNAs和基因的差异表达和(b)缺硼对柑橘根叶主要代谢途径的影响，旨在从生理和分子水平阐明柑橘耐缺硼的机制。主要结果如下：.1)通过Illumina测序，我们分离了更多的缺硼响应 miRNAs从叶（91上调的和81下调的miRNAs）比从根（52上调的和82个下调的miRNAs）；且大多数年缺硼响应miRNAs仅从根或叶分离，仅有22缺硼响应 miRNAs是根叶共同拥有的。而且，这22个共同miRNAs中有 11 miRNAs在缺硼根叶中表现出不同的表达趋势。总之，缺硼诱导的miRNAs表达改变在根叶中存在着很大的不同。.2)根叶miRNAs主要通过调节以下几个方面来适应缺硼：(a)维持适应缺硼胁迫的根叶表型；(b)维持适宜的生长素信号传递平衡；(c)激活根叶防御反应、ROS信号和清除能力，减少ROS累积；(d)增强细胞运输；(e)增强胁迫抵抗能力；(f)改善根系渗透调节和其它代谢反应和(g)增强叶呼吸和相关代谢。.3)应用5’-RACE 对miR160a 的4个靶基因和miR397a的2个靶基因进行了验证；克隆了miR472和miR397a前体序列；获得了miR397a的2个靶基因（LAC17和LAC4）的全长序列，并成功将其ORF序列成功克隆到T载体上；建立了适用于柑橘遗传转化的再生体系。.4)缺硼叶有过量累积的非结构性碳水化合物和低的CO2同化速率，证实了光合作用的反馈抑制；在叶中，呼吸和有机酸代谢上调以消耗过多的碳。相反，缺硼根积累的非结构碳水化合物比对照低，相应地，为了在可利用碳源较少的缺硼根中维持净碳的平衡，缺硼根中呼吸和有机酸代谢下调。.5)缺硼叶中上调表达基因数多于根，下调基因则相反，且大部分基因只在根或叶中表达，这可能与非结构性碳水化合物在叶片中累积而在根系中减少有关。.总之，缺硼柑橘可通过转录调节、转录后调节和代谢过程调节等机制维持适宜的根叶表型；改善叶片光能利用率，减少过剩光能的增加，增强抗氧化系统相关的代谢途径，使叶片免受或少受光氧化伤害，增强胁迫抵抗能力以响应缺硼胁迫。.