动脉炎病毒细胞嗜性蛋白的鉴定

Our previously studies showed that A PRRSV infectious cDNA clone that was equipped with open reading frames (ORFs) encoding minor envelope and E proteins of equine arteritis virus (EAV), the only known arterivirus displaying a broad tropism in cultured cells, was viable. Strikingly, this chimeric virus (vAPRRS-EAV2ab34) acquired the broad in vitro cell tropism of EAV but lost this ability to infect the PAM,demonstrating that the minor envelope proteins play a critical role as viral attachment proteins. In this proposal, we aim to identify the structural proteins responsible for the cell tropism of Arteriviruses. Based on the EAV and PRRSV infectious cDNA clones, a series of chimeric clones, in which the minor envelope protein genes (ORF2, ORF3 or ORF4) of PRRSV are replaced by the corresponding EAV gene set, are constructed. The chimeric viruses are rescued and used to analyse theirs cell tropism. Finally, we construct a chimeric clone in which envelope protein genes of PRRSV were replaced by the corresponding LDV gene set. We then investigate whether the PRRSV/LDV chimeric virus can infect in mice. Our studies will enhance our understanding of arterivirus entry and may be of great significance for the rational design of PRRSV vaccines and antiviral compounds.

在我们前期研究工作中，根据PRRSV和EAV具有不同细胞嗜性的特性，通过反向遗传操作，将PRRSV的GP2/GP3/GP4编码区替换为EAV相应对的区域，获得嵌合克隆pARRSV-EAV234，对拯救的嵌合病毒vARRSV-EAV234的细胞嗜性进行研究发现,嵌合病毒有着EAV一样广谱地细胞嗜性，但失去对猪肺泡巨噬细胞的感染性，说明GP2/GP3/GP4决定了PRRSV细胞嗜性。在本项目中，我们拟在EAV和PRRSV感染性克隆的基础上，构建两者GP2，GP3或GP4编码区相互替换的嵌合克隆，拯救嵌合病毒，研究嵌合病毒细胞嗜性的变化，进一步确定PRRSV和EAV的细胞嗜性蛋白。最后，构建PRRSV-LDV234嵌合克隆，探讨通过LDV GP2/3/4作为细胞嗜性蛋白来介导PRRSV感染小鼠模型的可行性。本研究将为我们理解动脉炎病毒的入侵机制以及研发抗病毒制剂靶标和优化疫苗设计提供理论依据。

实验前期构建的pAPRRSV-E234嵌合克隆，拯救出的嵌合病毒不仅仅能够感染MARC-145细胞,而且能够感染PRRSV的非易感细胞，如BHK-21,Vero细胞。但是却失去了对PAM的感染性。这也说明了PRRSV GP2/GP3/GP4复合体或者其中的某个蛋白可作为细胞受结合蛋白介导病毒进入细胞。.在EAV感染性克隆的基础上，构建pEAV- PRRSV GP2/3/4嵌合克隆，转染细胞后未能拯救出重组病毒。通过分析亚基因组。发现嵌合克隆pEAV- PRRSV GP2/3/4未能转录出PRRSV GP3/4的亚基因组，所以相应的蛋白未能表达。构建了pAPRRSV-EAVGP2，pAPRRSV-EAVGP3，pAPRRSV-EAVGP4，但是由于动脉炎病毒基因组结构的特性，即基因组之间有较长的重复序列（100-300nt）,单独替换基因势必为影响另外一个基因的表达。这些嵌合克隆均未能拯救的病毒。为解决蛋白之间重叠区的问题。我们在PRRSV感染性克隆的基础上，在ORF4/5和7/3插入EAV GP4。这样就不影响其他基因的表达，但是，拯救出来的病毒的EAV GP4蛋白不稳定，很难确定GP4是否是确定动脉炎病毒的细胞嗜性蛋白。为解决这一问题，我们通过慢病毒表达载体构建PRRSV或EAV GP2/3/4的细胞系。转染这些表达病毒蛋白的细胞系单独敲除了GP2/GP3/GP4的PRRSV或EAV全长突变克隆，通过间接免疫荧光实验发现单独敲除了GP2/GP3/GP4细胞系中能够拯救出病毒。推测细胞系中对应蛋白的表达对于病毒的产生可能起到一定的作用。目前，我们对敲除单个蛋白的全长克隆感染细胞实验进行补充，然后验证收取的相关的细胞毒能否在细胞系上稳定传代。在初步得出结论后将在单个蛋白表达的细胞系的基础上进行蛋白双表达以及三个蛋白共同表达细胞系的构建，同时构建敲除GP2/GP3/GP4两个或三个的全长克隆。按照最初类似的实验方法进行实验，对嵌合病毒进行拯救，并观察嵌合病毒的细胞嗜性变化，最终鉴定动脉炎病毒细胞嗜性蛋白。我们也构建了PRRSV-LDV GP2/3/4。尽管pPRRS-LDV GP2/3/4能够表达出相应的亚基因组，但是由于表达的LDV GP2/3/4蛋白可能未必能够组装成感染性的病毒粒子,为此，也未能拯救出病毒。.总之，我们构建多种PRRSV/EAV嵌合克隆和PRRSV