RSV编码的NSvc2蛋白在灰飞虱传毒中的功能研究

近年来由灰飞虱传播RSV引起的水稻条纹叶枯病在我国广大稻区爆发流行，对水稻生产构成极大威胁。然而对灰飞虱传播RSV的机制还知之甚少。申请人通过生物信息学分析发现RSV NSvc2蛋白与番茄斑萎病毒（TSWV）膜糖蛋白GN/GC存在诸多相似点，NSvc2可预测切割成两个蛋白，而TSWV GN/GC的缺失能导致蓟马传毒能力的丧失，NSvc2是否与灰飞虱传播病毒相关还有待深入研究。本项目拟通过western bolt等方法，明确NSvc2是否确实编码两个蛋白，并通过蛋白饲喂、灰飞虱传毒接种等方法，明确NSvc2前体及切割蛋白对灰飞虱传毒的影响；同时构建预测切割位点突变的NSvc2突变体，分析切割位点突变对灰飞虱传毒的影响，明确NSvc2是否必须通过切割产生两个蛋白后对传毒起作用；通过糖基化检测明确NSvc2蛋白是否为糖蛋白，分析去糖基化对灰飞虱传毒的影响。结果有望在RSV传毒因子方面有新的突破。

水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播水稻条纹病毒（RSV）引起的，研究灰飞虱传毒机制是防治该病害的关键。RSV的NSvc2蛋白与TSWV的膜糖蛋白（参与蓟马传播的决定因子）在基因组结构方面相对应，因此，推测NSvc2蛋白为RSV参与灰飞虱传播的决定因子。为此，本项目围绕RSV膜糖蛋白NSvc2展开了研究。.对NSvc2蛋白进行结构预测，绘制NSvc2蛋白拓扑结构示意图，预测NSvc2为糖蛋白，在寄主体内存在切割现象，被切割成2个蛋白R-GN/R-GC行使功能。经Western-blot分析验证，NSvc2在水稻中被切割成2个蛋白，与预测结果基本一致；在灰飞虱体内，NSvc2为完整的94 kDa蛋白，无切割现象。这是首次发现RSV NSvc2蛋白在水稻和灰飞虱体内以2种不同的形式存在，与RSV其它基因产物不同。.激光共聚焦观察R-GN、R-GC蛋白在植物中的亚细胞定位，结果显示R-GN定位于叶片细胞的高尔基体，R-GC定位于细胞的内质网上，同时R-GN具有将R-GC招募到高尔基体上的功能，这也间接证明了R-GN与R-GC之间的互作关系。.以R-GN为诱饵，筛选灰飞虱酵母双杂交cDNA文库，获得了3个互作膜蛋白。选取一个重要的蛋白，完成了基因克隆。经NCBI比对没有发现其同源基因，确定其为一个灰飞虱的特有蛋白，命名为GN-Rp。蛋白互作分析证实了GN-Rp与R-GN的互作，并发现GN-Rp与RSV-CP没有互作关系。GN-Rp的表达量与灰飞虱的获毒和传毒能力在时间方面是呈正相关的。.以RNAi干扰昆虫体内R-GN的表达，发现R-GN表达受到抑制后，与对照相比，带毒灰飞虱将RSV传给水稻植株的能力无显著变化。由于传毒屏障在介体唾液腺，因此，R-GN很可能没有参与RSV与介体唾液腺的互作，而是参与了RSV与介体中肠屏障的互作。.对带毒灰飞虱体内的RSV内含体进行了电镜观察，发现灰飞虱卵巢滤泡细胞内有大量的不定形RSV内含体，其形态结构与水稻组织中的RSV内含体基本一致，暗示RSV在灰飞虱卵巢滤泡细胞内复制和积累强烈，这是首次报道灰飞虱体内的RSV内含体。.本项目为进一步分析NSvc2在灰飞虱传播RSV过程中的功能奠定了基础。发表论文11篇，培养硕士生3名，达到了预期目标。