纳米二氧化钛影响线粒体DNA复制过程的研究

纳米二氧化钛因其特殊的理化性质和良好的抑菌性而被广泛应用于食品保鲜领域。由于纳米二氧化钛生成的活性氧对DNA分子具有氧化损伤作用，同时线粒体dNTP 和DNA聚合酶γ均易受到活性氧的影响，造成线粒体DNA 复制产生较高的突变率，所以有必要从线粒体的角度研究其遗传毒性。本申请拟采用分子生物学的方法研究纳米二氧化钛对线粒体DNA 复制过程的影响，主要考察线粒体dNTP 变化、DNA 聚合酶γ性质和复制产物的突变率。一方面研究纳米二氧化钛影响线粒体dNTP 的组成，通过体外基因扩增实验研究DNA 聚合酶.γ的性质变化，最后采用rpsL 基因检测纳米二氧化钛造成的产物突变率；另一方面采用抗氧化物质有针对性地保护dNTP 和酶，降低线粒体DNA 突变率。此外，利用原子力显微镜考察纳米二氧化钛与酶、DNA 的相互作用。通过纳米二氧化钛对线粒体DNA复制过程的影响，从亚细胞水平研究二氧化钛的生物学效应。

纳米二氧化钛（TiO2 NPs）广泛地应用于涂料，食品包装与保鲜，化妆品，环保，医疗，印刷等领域。纳米二氧化钛独特的小尺寸效应，表面效应，量子尺寸效应及宏观量子隧道效应等导致其不同于常规粒子的特殊热、磁、光敏感、表面稳定性等特性。随着纳米二氧化钛的广泛应用，其安全性也受到越来越多的关注，其对生物有机体、组织器官、细胞的毒性也逐渐地被科学实验所证实。本课题A549细胞为主要研究对象，分别从细胞、亚细胞、分子水平研究了不同浓度的TiO2 NPs对线粒体DNA复制的影响。结果表明TiO2 NPs（50, 100, 200 μg/mL）可以抑制A549细胞生长，降低线粒体膜电位，通过线粒体途径诱导A549细胞凋亡，显著延长A549细胞G2/M期（100, 200 μg/mL），增加凋亡细胞比例。彗星实验和DAPI染色表明TiO2 NPs（50, 100, 200μg/mL）可以对A549细胞DNA造成损伤。利用荧光定量PCR方法研究了TiO2 NPs在体外对DNA复制的影响，5, 10, 20, 40 μg/mL TiO2 NPs促进扩增反应，降低Ct值，5, 10 μg/mL TiO2 NPs促进作用最强，浓度80, 160 μg/mL时抑制扩增反应，升高Ct值。荧光定量PCR实验表明TiO2 NPs（50，100, 200 μg/mL）可以显著抑制A549 DNA聚合酶 γ 催化亚基基因POLG1和附属亚基基因POLG2的表达，从而影响线粒体DNA复制，造成线粒体拷贝数降低。以上结果表明TiO2 NPs对线粒体DNA复制具有浓度依赖的抑制作用，且随着浓度增大抑制作用增强。