构建重组腺相关病毒分泌表达NT4-CGRP治疗鸡胚血管痉挛的实验研究

Cerebral vasospasm (CVS) after subarachnoid hemorrhage (SAH) is one of the serious complications with higher incidence and mortality rate. Until now its pathogenesis is not clear, which makes the treatment difficult and unsatisfactory. This experiment chooses chick embryo chorioallantoic membrane vessel (CAM) as CVS model, because this type of vessel resembles cerebral vessels in morphology. The CAM vessels will be observed dynamically at any time. The advantage of this model includes good continuity, short cycle, high success rate and repeated operation. This experiment successfully established CVS model of chick embryo's CAM vessel after a numbers of continuous exploration. Some studies have shown that Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) is the strongest substance to dilate the vessels and even some studies reported that CGRP can be used to prevent and relieve the CVS after SAH. Since exogenous CGRP does not across the blood brain barrier（BBB），the concentration is not well maintained and thus the treatment is not affected well. This experiment successfully packaged out adeno-associate virus with NT4-CGRP fusion gene. The virus produced endogenous CGRP stably after the chick embryo CAM endothelial cells were infected by it to treat CVS.

蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛（CVS）危害较大，至今尚无确切有效的治疗方法。本课题采用鸡胚尿囊膜（CAM）血管制作CVS模型；CAM血管接近脑血管，成模后可实时观察，且具有周期短及可重复的特点，这就弥补了其他模型的诸多不足；课题组在前期工作中已成功的建立了鸡胚CAM的CVS模型。在治疗方面，选用降钙素相关肽（CGRP）进行研究，CGRP是现已知的最强的扩血管物质，已证实应用CGRP可以防治CVS。但外源性CGRP不仅合成技术复杂、成本高，而且无法通过血脑屏障，血药浓度难以维持。本实验通过转基因方法，已成功包装出带有表达核NT4-CGRP融合基因的腺相关病毒，并经RT-PCR测定了病毒滴度及免疫组化证实了CGRP的表达。本课题拟利用病毒感染鸡胚CAM血管，使其长期稳定表达内源性CGRP治疗CVS，不但为CVS的研究提供一新的动物模型，而且也为治疗CVS提供一种治疗手段，前景广阔。

鸡胚尿囊腔内的尿囊腔脐动脉所处的液体环境与人脑血管所处的蛛网膜下腔液体环境很相似，附于蛋壳内面的CAM血管在灯光照射下清晰可见。我们尝试通过用针刺CAM血管引起鸡胚尿囊腔内出血，观察是否可以诱导鸡胚尿囊腔脐动脉血管痉挛，模拟aSAH出血后CVS的病理变化。并通过尿囊腔注射建带有CGRP基因的真核生物表达载体rAAV-CGRP，验证了rAAV-CGRP改善鸡胚尿囊腔脐动脉痉挛中的可行性。结果显示：1、实验组造模后1day时的脐动脉血管内径横截面积及管壁厚度与对照组相比，无统计学差异，3day，5day，7day时的脐动脉血管内径横截面积显著小于同期对照组（p<0.05），脐动脉管壁厚度厚于同期的对照组(p<0.05)；实验组脐动脉管壁细胞的凋亡指数明显高于对照组（p<0.05）；造模后5day时的脐动脉管壁透射电镜观察可以看到实验组内皮细胞浓缩，失去细胞间正常的连接，排列疏松，细胞核核质碎裂，向核膜周边聚集，内皮下弹力层可见波浪形皱褶，对照组内皮细胞单层排列，核呈椭圆形，细胞间连接紧密，胞核也呈椭圆形，内皮下层排列整齐，层次结构清楚。2、尿囊腔途径给予AAV组3day，5day，7day的鸡胚尿囊腔脐动脉血管内径横截面积仅为同日龄对照组的67.33%，59.19%，57.22%，脐动脉管壁厚度比同日龄对照组增厚12.17%，17.59%，18.95%。而rAAV-CGRP组造模后3day，5day，7day脐动脉血管内径横截面积为同日龄对照组的86.11%，79.75%，77.60%，脐动脉管壁厚度比同日龄对照组增厚5.00%，8.21%，9.73%，血管痉挛程度发生显著改善（p<0.05）。rAAV-CGRP组造模后3day，5day，7day时鸡胚尿囊液中CGRP的浓度显著增高AAV组相当于与AAV组的数倍（p<0.05）。因此：针刺CAM血管造成尿囊腔内出血，诱导脐动脉血管痉挛模型可以建立类似与哺乳动物蛛网膜下腔出血诱导的脑血管痉挛的一些病理变化特点，具有一定的应用价值；经尿囊腔途径给予rAAV-CGRP能够提高鸡胚尿囊腔内出血诱导的血管痉挛模型的存活率，显著改善脐动脉血管痉挛，增加鸡胚尿囊腔中CGRP的表达，同时也为寻找其它靶基因基因治疗血管痉挛提供了新的实验模型。