A型血友病的基因治疗：利用重组腺相关病毒表达高分泌能力的FVIII因子

Hemophilia A is a kind of coagulation disorder caused by X-linked Factor FVIII gene and the occurrence rate is 1:5000 in males. Current therapy is to use exogenous Factor FVIII to treat patients. This replacement therapy is very costly, up to 350,000 US$/patient/year, and 30% patients develop inhibitors due to repeated injections. Gene therapy based on recombinant adeno-associated virus (rAAV) is believed to be the most promising therapy to cure the disease and avoid the development of inhibitors. We have been focused on rAAV gene therapy for Hemophilia A for many years and invented novel FVIII molecules with higher activity and a new scalable production system for rAAV. Since porcine Factor FVIII has 10-100 folds higher secretion capacity than human one, we propose that porcine Factor FVIII domains responsible for high secretion could be identified by comparison of the activity and quantity of secreted FVIII hybrids of human and porcine. The key amino acids responsible for the high secretion could also be identified by further fine mapping. Based on the above analysis, we could engineer FVIII molecules with enhanced secretion by replacing the key amino acids of human FVIII with porcine ones. The high secretion mechanisms of this engineered FVIII molecules will be studied by co-localization with organelles of the secretion pathway using confocal microscopy. The structure of expression cassette for new FVIII molecules will be optimized to overcome the packaging limit of rAAV. Finally, the rAAVs for Hemophilia A produced in large scale using our new production system will be used to correct the phenotype of mouse model, which would be valuable for the coming clinical trial in China.

A型血友病是由X染色体编码的FVIII因子缺陷引起的凝血功能障碍，男性发病率为1/5000。目前治疗方式为输入外源FVIII因子，费用达35万美元/人/年，而且30%的病人会产生抗体。利用重组腺相关病毒（rAAV）的基因治疗可以“一次治疗，终身有效”，避免抗体产生，其中表达高分泌的FVIII因子是关键。本课题组一直从事该病的rAAV基因治疗，发明了高活力的FVIII因子和rAAV规模化包装方法。猪的FVIII因子分泌比人的高10-100倍，因此本课题提出通过分析人猪结构域互换的FVIII杂合体的分泌能力，可以发现高分泌相关的结构域；进一步进行氨基酸互换发现和高分泌相关的少数氨基酸，从而构建高分泌的人源FVIII因子。其后通过激光共聚焦分析FVIII因子和其分泌途径相关的细胞器共定位发现高分泌的机制。最后在优化表达框架后，制备携带高分泌FVIII的rAAV进行模式小鼠试验，为临床治疗做准备。

A型血友病 (HA) 是由X染色体编码的FVIII因子缺陷引起的凝血功能障碍，男性发病率为1/5000。目前治疗方式为输入外源FVIII因子，费用达35万美元/人/年，而且30%的病人会产生抗体。利用重组腺相关病毒（rAAV）的基因治疗可以“一次治疗，终身有效”，避免抗体产生。. rAAV基因治疗的关键是获得高活力的FVIII因子。FVIII因子的活力=单位酶活x酶含量，我们的研究是提高酶含量入手。成熟的FVIII因子由一个重链和一个轻链构成，是分泌蛋白，人的FVIII因子的分泌能力相对于一些动物较低，例如比猪的FVIII因子低10-100倍。因此本课题的主要内容是（1）提出通过人和其它动物包括猪的FVIII结构域互换获得杂合体；（2）通过杂合体分泌能力的变化发现高分泌相关的结构域；（3）进一步进行氨基酸互换发现和高分泌相关的少数氨基酸，从而构建高分泌的人源FVIII因子；（4）优化表达框架后，制备携带高分泌FVIII的rAAV进行HA 模式小鼠试验，为临床治疗做准备。. 以下是我们研究的重要结果（包括关键数据）（1）通过结构域互换，我们发现FVIII的重链的A1结构域与其分泌能力紧密相关；（2）通过改变重链A1结构域上的2-5个氨基酸，可获得分泌能力提高2-4倍的FVIII因子；（3）利用基因工程获得的高活力FVIII因子进行rAAV基因治疗，和正常FVIII因子相比，在同样剂量的条件下在A型血友病小鼠的体内活性提高5-10倍，有更好的治疗疗效。依靠基金的支持，已发表相关SCI论文2篇，申请国际专利1项。. 我们的研究加深了对FVIII因子分泌机制的认识，为A型血友病的rAAV基因治疗奠定了坚实的基础。