光氧化交联的去细胞肿瘤细胞外基质（ECM）的制备与性能研究

肿瘤工程是用组织工程技术在体外构建三维肿瘤，但目前用于肿瘤工程研究的三维支架存在种种不足。为寻求一种理想的肿瘤培养三维支架，我们前期以肺腺癌A549系细胞种植免疫缺陷鼠所得到的肿瘤组织块为材料，切成薄片后去细胞处理，得到一种去细胞肿瘤细胞外基质（ECM）支架，随后用光氧化交联的方法增加支架刚度。本研究拟完成：（1）完善支架制备过程，对去细胞和进一步不同程度光氧化交联的ECM的结构和机械性能进行全面评价；（2）以3种不同系肿瘤细胞在所制备支架上三维培养，用病理学和分子生物学方法研究细胞生长情况和恶性生物学行为，并研究体外三维培养下肿瘤细胞的耐药性；（3）通过肿瘤细胞三维培养后鼠体内植入实验，研究去细胞和进一步光氧化交联所得ECM对肿瘤恶性生物学行为的影响。本研究力图制备一种空间排布和生物机械性能理想的三维肿瘤工程支架，利于肿瘤发生、血管生成、转移机制和耐药性等进一步的研究。

为寻求一种理想的肿瘤培养三维支架，我们以人肺腺癌A549肿瘤细胞种植免疫缺陷鼠而得到的肿瘤组织块为材料去细胞处理，去细胞后材料用MCF-7细胞等不同系肿瘤细胞种植。项目按照预期顺利进行。研究成果已经发表在PLoS One和现代肿瘤医学杂志上，并且获得了国家新型专利1项。我们对材料的消毒和保存方法也有研究，对冷冻干燥后去细胞肿瘤细胞外基质的组织结构、机械性能以及三维肿瘤细胞培养情况有深入研究，文章已经整理，近期向国外杂志投出。去细胞肿瘤ECM 薄片接受不同时间光氧化交联，扫描电镜提示光氧化组表面细胞团状分布，荧光活细胞染色进一步证实了这一点。H&E截面染色提示光氧化交联组肿瘤细胞呈灶团样生长，和体内肿瘤生长形态更相似。进一步细胞增殖计数和细胞因子检测证实光氧化组更适合肿瘤细胞增殖，并合成更多的IL-8。对体外培养10天，进一步Western blot检测肿瘤恶性转化标识显示光氧化组的E-cadherin与去细胞组和2D培养相比较减低，而N-cadherin, Paxillin均增高，vimentin略增高。Real-Time PCR 检测E-cadherin 的mRNA 表达减低，其转录抑制剂Slug的mRNA表达增高。说明肿瘤在光氧化组中培养更趋于向恶性表型转化。肿瘤细胞2D培养组成瘤1月后瘤体最小，光氧化组瘤体最大，并且CD31标记的新生血管最多，并且血管相对粗，Ki67标记阳性细胞比例光氧化组最高，免疫组化E-cadherin的表达光氧化组最低，其转录抑制剂Slug的表达最高，Western blot检测进一步证实了免疫组化的结果。肿瘤细胞2D培养组成瘤1月后瘤体最小，光氧化组瘤体最大，并且CD31标记的新生血管最多，并且血管相对粗，Ki67标记阳性细胞比例光氧化组最高，免疫组化E-cadherin的表达光氧化组最低，其转录抑制剂Slug的表达最高，Western blot检测进一步证实了免疫组化的结果。MCF-7、HepG2和A549细胞在光氧化和去细胞组肿瘤细胞外基质支架上三维培养10 天后培养液更换为含不同浓度化疗药顺铂后显示相同浓度下，光氧化组的细胞成活率更高，IC50光氧化组最高。说明光氧化组支架培养的肿瘤细胞更耐药，和活体肿瘤的生物耐药性能相似，因为活体肿瘤较2D细胞对化疗药不敏感。本部分是本研究的精华部分，已经完成，近期将会投出发表高水平论文。