基于靶点“钩钓”策略的连翘苯乙醇苷类抗黑色素瘤药理靶点鉴定和抑制剂的快速发现研究

Melanoma is a common skin tumor caused by hyperproliferation of abnormal melanocytes. The key to treatment is to develop effective targeted drugs. Forsythia suspense as a heat-clearing and detoxifying, swelling of the representative of the drug, the efficacy of treatment of melanoma has been clinically and pharmacologically confirmed. Our previous study showed that phenylethanoid glycosides have a good anti-melanoma B16 cell activity in vitro (inhibition rate of 75.2%), and high levels of Forsythia to play the core activity of the material basis, but the basis of the drug substance and the mechanism have not yet been clarified..In this study, phenylethanoid glycosides was used as the research object, and the “target fishing” was used to identify the pharmacological targets and inhibitors of melanoma. Phenylethanoid glycoside species are linked to the solid matrix microspheres by chemical bond. Then the integral microspheres would capture the corresponding target proteins and in the same time combine them in the tumor cell lysate. Active ingredients of phenylethanoid glycoside and target proteins are respectively identified by high resolution mass spectrometry. The target inhibitor which further verified by pharmacology in vitro was enriched by the method of guided separation. The method of the research will provide experimental evidence for further development and clinical application of Forsythia suspense, which is a useful exploration of finding anti-melanoma leading compounds from natural drugs.

黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，治疗的关键是开发针对其靶标作用的有效药物。连翘作为清热解毒，消肿散结的代表性药物，治疗黑色素瘤的疗效已被临床和药理实验证实。本课题组前期研究表明：苯乙醇苷类成分具有很好的体外抗黑色素瘤B16细胞活性（抑制率75.2%），且含量较高，为连翘发挥活性的核心物质基础，然而药效物质基础和作用机制尚未阐明。.本课题将以连翘苯乙醇苷类为研究对象，基于“钩钓”策略，将连翘苯乙醇苷类成分通过化学键合手段链接到固相基质微球表面，利用该微球从肿瘤细胞裂解液中特异性捕捉相应的靶标蛋白，并进行高分辨质谱鉴定。进而通过导向分离的方法进行上述多重靶点抑制剂的“快速”富集和鉴定，并进行药理学体外实验验证。本课题的研究思路将为连翘的进一步开发和临床应用提供实验依据，是从天然药物资源中寻找治疗黑色素瘤先导化合物的有益探索。

项目组对中药连翘进行了系统的化学成分研究，共分离得到单体化合物63个，鉴定了全部化学成分的结构，其中包括11个新化合物；对连翘中双四氢呋喃木脂素类化学成分及其波谱特征进行了总结；对连翘中酚酸类成分的研究进展进行了综述研究；对不同产地、不同种的连翘种子的挥发油成分进行了鉴定。采用网络药理学与分子对接相结合的方法，分别研究了连翘抗肿瘤和抗黑色素瘤的主要成分、关键靶点和信号通路，并通过分子对接的方法进行了验证。采用“钩钓”策略，将苯乙醇苷通过化学键的手段来链接到固相基质微球表面，利用该微球从细胞组织裂解液中特异性捕捉相应的蛋白，通过高分辨质谱分析，得到181个潜在的靶点蛋白。通过生物信息学分析，对鉴定得到的181个靶点蛋白进行了研究。KEGG分析发现，这些靶点参与了62条相关信号通路，分析得到匹配度最高的前10个通路。采用MTT比色法考察了63个单体化合物对人恶性黑色素瘤细胞A-375、小鼠黑色素瘤细胞B16和小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16-F10的抑制作用。结果显示有39个单体化合物（浓度为40μM）平均抑制率大于50%，且其他化合物也具有一定的抑制作用。虽然没有发现活性极其突出的小分子抑制剂，但总体上都具有抑制作用。说明中药连翘治疗黑色素瘤并非是单一成分起作用，而是通过"多成分、多途径、多靶点"的方式产生疗效。在此项目的资助下，发表相关研究论文6篇，其中SCI研究论文3篇，北大核心3篇；参加会议3次。培养科技骨干3名，硕士生3名。