基于小RNA及降解组测序的香蕉在枯萎病菌诱导下的miRNA表达与调控机制研究

Banana is one of the main tropical fruits in the world, and also the most important economic crops in Hainan. In recent years, banana wilt disease caused by Fusarium oxysporum fs.p.cubense outbreaks in large scales, lead great loss to banana production. Researching on pathological molecular mechanism of banana wilt disease has important theoretical and practical significance. In our finished NSF project, we carried out transcriptome sequencing and digital gene expression profile sequencing related to banana wilt disease, got a plenty of differential expressed genes, and established efficient research platforms. In this proposal, we plan to combine small RNA sequencing and degradome sequencing technique to study banana wilt disease deeply by microRNA, take "Brazil" banana variety and Fusarium oxysporum fs.p.cubense race 4 as genetic material, through pathogen inoculation experiments, small RNA sequencing, degradome sequencing, bioinformatics analysis, to get the differential expression profile of microRNAs and its target mRNA genes of banana induced by pathogenic infection; screen out the important microRNAs and its target genes related to banana pathogenic reactions, analyze the microRNA and its target gene's expression profile and regulation mechanism of banana induced by wilt disease pathogen, do functional verification for important microRNAs and its target genes.

香蕉是全世界重要的热带水果，也是海南主要的经济作物。近年来，尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种引起的枯萎病大面积爆发，给香蕉生产和产业发展造成了巨大损失。研究香蕉枯萎病的病理反应分子机制，具有重要的理论意义和应用价值。本课题组在已结题国家基金项目中，完成了香蕉的转录组测序及香蕉在枯萎病菌诱导下的数字基因表达谱测序，筛选到大量差异表达的基因，建立了成熟的技术体系。本项目拟联合采用小RNA测序和降解组测序，从miRNA的角度对香蕉枯萎病进行更加深入系统的研究，以香蕉"巴西蕉"及尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种为遗传材料，通过病原菌接种实验、小RNA测序、降解组测序、生物信息学分析，获得香蕉在病原菌诱导下miRNA及其靶mRNA基因的差异表达谱；筛选出香蕉病理反应相关的主要miRNA及其靶基因，解析香蕉在枯萎病菌诱导下的miRNA及其靶基因的表达模式与调控机制，并对重要miRNA及其靶基因进行功能验证。

miRNA是一类非编码的单链小分子RNA，约18~25nt长度，主要对靶基因进行转录后调控。在植物的生长发育、逆境胁迫、表观遗传等方面起着非常重要的作用。.本研究联合采用高通量小RNA测序和降解组测序技术，以香蕉品种“巴西蕉”及尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种为遗传材料，构建病原菌侵染四个阶段的小RNA库和降解组库，结合生物信息学分析，建立香蕉在病原菌诱导下不同时段的miRNA差异表达谱，获得香蕉病理反应相关的已知miRNA和新miRNA，并确定各miRNA所对应的靶基因，通过qRT-PCR进行验证，解析香蕉在枯萎病菌诱导下的miRNA及其靶基因的表达模式和调控机理。.取得的主要结果如下：1）通过小RNA高通量技术进行测序，建立了Banana CK、Banana 4h、Banana 24h、Banana 6d等4个小RNA库，测序分别得到16013204、16551770、17733937和18429778条序列，分别筛选得到Clean reads 15795656、16359862、17492456、18056899条。通过将clean reads与miRBase中miRNA前体或成熟体序列进行比对，获得1220个已知miRNA和443个候选miRNA。 2）通过降解组测序，Banana CK、Banana 4h、Banana 24h、Banana 6d分别获得total tags 19376180、20031339、19529695、20425417条。分别筛选获得clean tags序列19181680、19934653、19436497和20327782条。鉴定miRNA的降解位点，确定miRNA对应的靶基因，共得到1288条对应关系，其中975个为已知miRNA，313个为候选miRNA。3）随机挑选20个miRNA，进行了qRT-PCR验证。挑选与病理反应相关的8个重要miRNA，构建其过表达载体，转化拟南芥。4）通过mfold软件预测了重要miRNA的前体，长度大小范围在112~225bp之间，都能形成茎环结构。.本项目研究为香蕉枯萎病的分子病理机制提供了新的遗传信息和理论揭示。