多功能双壳层聚离子复合物胶束非病毒基因载体的构筑及其在肿瘤基因治疗上的应用

Gene therapy is a promising technique to treat a lot of intractable diseases and received plenty of attention. However, the design of safe and efficient gene delivery vectors is a critical issue for successful gene therapy. Traditional nonviral gene carriers are unstable in the blood circulation because of high salt concentration and the attack of DNase enzyme in the bloodstream, which leads to low transfection efficiency in systemic gene delivery. This project will be focused on fabrication of multifunctional gene carriers with two-layer shells on the basis of biocompatible and biodegradable poly(amino acid). Two approaches will be carried out to improve the stability of gene vectors in the blood circulation and their in-vivo transfection efficiency. First, polyplex micelles with two-layer shells containing polyethylene glycol (PEG) layer and a thermo-responsive hodrophobic layer will be constructed via complexation between the mixture of two polymers and plasmid DNA (pDNA). Second, another type of polyplex micelles with a PEG layer and a layer associated by hydrogen bond will be prepared via complexation between poly(amino acid)-based triblock copolymers and pDNA. Moreover, we will introduce tumor targeting group cyclic RGD and redox-responsive disulfide bond into the above two polyplex micelles to achieve in-vivo targeted gene delivery and efficient endosome escape. This project will explore the laws of self-assembly into polyplex micelles with multilayer shells, overcome the challenge of unstability in blood circulation and low transfection efficiency in systemic gene delivery, and provide a novel model for the design of high-efficiency gene vectors in cancer gene therapy.

基因治疗对多种重要疾病表现出很高的治疗价值，而安全高效的基因传输载体是基因治疗关键所在。传统非病毒载体由于在血液循环中稳定性较低,导致体内基因治疗效率很低。本项目将基于生物相容可降解聚氨基酸阳离子嵌段聚合物，通过两种途径制备含双壳层多功能基因载体,以提高其在血液循环中的稳定性及体内转染效率。首先,通过两种嵌段聚合物共混与DNA络合,调节温度自组装制备含聚乙二醇（PEG）和温敏性疏水层的双壳层结构;其次，采用具有氢键相互作用的三嵌段聚氨基酸与DNA络合，自组装制备含PEG和氢键作用层的双壳层结构.此外，在两种体系中引入肿瘤靶向配体环形RGD短肽和氧化还原响应性基团二硫键，实现基因的靶向传输和高效转染。本项目将进一步揭示通过静电复合自组装制备多层结构稳定聚离子复合物胶束的规律，解决传统非病毒基因载体在血液循环中稳定性低导致转染效率低下的问题，为肿瘤基因治疗非病毒载体的设计提供更加高效的模板。

基因治疗对很多常规方法难以治疗的疾病表现出了很高的治愈前景，越来越收到人们的关注。发展高效的基因载体依然是基因治疗的关键科学问题之一。通常通过体外实验筛选出来的高效的基因载体在体内环境中的表现往往不能够达到预期效果。本项目重点关注体内环境中高稳定性的基因载体体系，能够在体内环境中实现高效基因表达的嵌段聚合物基因载体。我们主要利用响应性嵌段聚合物在基因输送的不同阶段，利用生理环境的不同刺激响应性聚合物进行结构上的调整，从而实现高效的基因输送。在本项目的支持下，我们主要完成了如下几个方面的工作：（1）通过两种嵌段聚合物共混与DNA络合，调节温度自组装制备含聚乙二醇(PEG)和温敏性疏水层的双壳层结构，仅仅通过在室温下络合，在体温条件下便可形成双壳层结构。该双壳层结构极大地提高聚离子复合物胶束在体内生理环境下的稳定性，对通过静脉注射的肿瘤基因治疗以及原位注射的椎间盘损伤基因治疗修复，都体现出了很高的效率。（2）提出了在肿瘤组织中，细胞外环境中，基质金属蛋白酶响应性去PEG的体系，解决了PEG在提高聚离子复合物胶束体内环境中的稳定性，但是抑制细胞内吞和内涵体逃逸的矛盾。（3）提出了将多种逃逸机理统一到一个分子中，以增加逃逸效率的策略。利用Passerini多组分反应将具有高效质子海绵效应的分子和易于与内涵体膜结合的长链烷基结合到一个单体中，聚合后得到的聚合物表现出了非常高效的内涵体逃逸效率。在本项目的支持下，以第一/通讯作者共发表影响因子>4的论文18篇，截止2017年2月所发表的论文被他引414次。受邀在国内全国性会议上做分会报告4次，国际会议上做分会报告2次。