新型非病毒基因载体PEI-壳聚糖-靶向肽对肿瘤干细胞上的靶向研究及其免疫基因治疗

PEI and chitosan are considered to be promising non-viral gene delivery vectors. To improve the transfection efficiency of chitosan, we would link chitosan with polyethylenimine (PEI,Mw= 1.8 kDa) by 1,1_-carbonyldiimidazole to form a complex. The composition, particle size, as well as the zeta potential of this chitosan-linked-PEI (CP) complex will be measured. And the DNA binding ability, cytotoxicity, and gene transfection efficiency of CP complex will also investigated in cancer cells.Recent studies elucidated the presence of cancer stem cells that have the exclusive ability to regenerate tumors. These cancer stem cells share many characteristics with normal stem cells, including self-renewal and differentiation. With the growing evidence that cancer stem cells exist in a wide array of tumors.The concept of cancer stem cells may have profound implications for our understanding of tumor biology and for the design of novel treatments targeted toward these cells.In this research we also want to link CP and some peptide which target to tumor stem cells,and investigate their physico-chemical properties as well as the biochemical propertyies.The threapy effect which induced by the target materials is our final hope.

PEI和壳聚糖是优秀的非病毒基因传递系统，但都存在其不足性。为了改善壳聚糖较低的转染效率，我们将其与低分子的PEI通过化合作用连接在一起，以期望得到高效安全的非病毒基因载体材料。材料的组成，粒径，电位等物理化学性质将被研究，同时转染效率以及细胞毒性也会在实验中被评估。近期，肿瘤干细胞是研究的热点，在本次课题中，会筛选适宜的肿瘤干细胞的靶向物，如小分子的多肽。将多肽与先前合成的新型材料再结合一起，就可能得到靶向肿瘤干细胞的非病毒载体。我们将会评价该载体针对肿瘤干细胞的特异性，分为体外及体内两块来研究。最终将携带治疗基因，希望能实现对肿瘤干细胞的治疗效果。

肿瘤的靶向治疗因其针对性强，对正常组织毒性小已经成为肿瘤综合治疗的重要组成部分。近年来，肿瘤干细胞因其增殖能力、抗化疗能力明显强于组织中的其他肿瘤细胞，越来越受到人们的关注，靶向肿瘤干细胞也成为现今研究的热点。但靶向肿瘤干细胞存在几大难点，1如何确定靶向的是“干性”肿瘤细胞，或者怎样来评价肿瘤细胞的干性？2如何找到合适的靶点3用何种方式将靶分子送入细胞内。本项目对此进行了积极的探索。针对筛选出具有干性的肿瘤细胞，本项目先后进行了原代细胞成球培养、成熟细胞株定向培养等手段，发现原代细胞生长不稳定，不易传代，细胞表面标记也不稳定，并不能作为良好的重复推广研究手段。鉴定肿瘤细胞的干性上，我们发现如果HCT116细胞的CD133表达高达93%，并且很容易培养为肿瘤球。且肿瘤球显示出较强的细胞侵袭力和小鼠成瘤率。但我们发现把肿瘤球的细胞再经过流式细胞仪进行 CD133含量的筛选，得到的细胞完全休眠，不具备任何成球性和分化能力。我们认为肿瘤干性细胞要发挥作用，其周围的微环境包括普通肿瘤细胞必不可少。因此我们的靶向目标就从流式筛选转为了抵抗力强，繁殖旺盛，侵袭力强的肿瘤细胞球。同时，因为CD133在肿瘤球细胞的高度表达，我们将其作为靶向治疗方案的靶点，以对CD133高度亲和的TR肽作为靶分子，进行非病毒材料的修饰。首先，我们用TR肽修饰PEG3400-DSPE，用于包裹阿霉素，评价其在肿瘤干细胞的靶向作用。研究表明不管是细胞水平或是动物水平，C-DOX-PTX均显示出对CD133高表达的HCT116干性细胞的的高杀伤力（与普通阿霉素脂质体相比）和特异性结合。与普通阿霉素脂质体相比，C-DOX-PTX能被CD133高表达的HCT116肿瘤干性细胞更多地摄取（流式细胞术检测），更低的IC50值。而经静脉注射后C-Dir-LIP明显分布在小鼠腹腔和腋下肿块部位，荧光信号强于普通阿霉素脂质体，且成像清晰，至24h后，C-Dir-LIP探针在体内的清除速度较Dir-LIP探针慢，显示更好的抗外排效应。在进一步的实验中我们发现C-DOX-LIP能更好地在体内抑制结肠癌肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存时间。在对不同结肠癌细胞株的侵袭力与CD133含量及转染效率进行探索时发现CD133高表达的结肠癌细胞有更强的转移力和致病力，抗转染能力，需要更强力的靶向分子，CD133亲和TR肽或许有潜在的可能。