肺炎支原体生物类群多样性研究

肺炎支原体是重要的呼吸道病原体，但其较小的基因组长度及有限的生物合成能力使肺炎支原体需要非常复杂的培养基添加成份才能在体外生长。由于体外分离培养困难，国内临床株收集保存有限，既往对临床分离株的生物学特征研究很少。通过培养方法改良申请人自2005年起已收集保存肺炎支原体临床株逾150株。在前期研究基础上，本研究计划对肺炎支原体生物类群多样性进行进一步研究：①种群多样性：呼吸道感染患者中进一步分离培养肺炎支原体，建立菌种库，采用多重位点串联重复序列分析方法进行聚类分析，构建数字化数据库，了解菌株间的进化关系；②生理类群多样性：毒力差异；生境适应性研究，采用DNA微阵列技术进行环境应答相关表达谱分析；③遗传多样性：临床分离株P1基因的变异特征；核糖体寡核苷酸序列差异和抗生素敏感性关系研究。本研究对于明确肺炎支原体类群丰度，阐明其基本生物学特性和遗传变异规律具有重要意义。

课题组严格按照课题计划书进行，目前已发表SCI文章3篇。主要研究内容有：1. 菌种库的不断完善 目前临床分离株数约250余株，均进行了药物敏感性试验。2. 种群多样性研究 对152株肺炎支原体采用多重位点可变数目串联重复序列分析方法（MLVA）进行了分型。152株肺炎支原体共被分为17个MLVA型，而其中137株大环内酯类耐药肺炎支原体被分为15个MLVA型。以上结果提示中国地区大环内酯类耐药肺炎支原体的流行来源于多个耐药克隆。3. 遗传多样性研究 建立变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）分析134株肺炎支原体临床分离株的p1基因变异情况，并与PCR-RFLP和测序法比较其在检测基因变异的作用。DGGE方法结果显示，共检测18株新突变株，与p1基因测序结果一致，优于PCR-RFLP的检测方法（14株）。通过Genbank 序列比对，18株临床突变株中，8株为MpⅡ型 V2c突变株；2株为MpⅡ型 V2a突变株；7株MpⅠ型临床株发生了点突变。此外，还发现了一株新型V2型突变株Mp100，其p1基因的序列均不同于Ⅰ、Ⅱ型，与目前报道过亚型和突变型相比也均有很大的差异，根据目前关于Mp临床突变株的研究，我们将此突变型命名为V2d型突变株。4. 生理类群多样性研究 本实验研究利用Real-time PCR显示在不同亚抑制菌浓度（0, 2, 32 µg/ml）的大环内酯类抗生素作用下，观察到肺炎支原体肺炎支原体粘附、代谢、毒力相关基因mRNA转录水平有显著变化；同时通过扫描电子显微镜观察到不同的亚抑菌浓度下肺炎支原体形态与生长状态有变化。5. 针对敏感及耐药菌株的遗传多样性突变特点建立快速检测方法 采用Cycleave PCR，设计荧荧光探针，特异性扩增耐药位点，实现快速诊断及耐药性检测一步完成。肺炎支原体分离株Cycleave PCR检测结果：101株肺炎支原体临床分离株中，19株无突变敏感株、81株A2063G突变耐药株和1株A2064G突变耐药株分别出现了与阳性对照pMD-FH、pMD-2063和pMD-2064相同的扩增结果，与常规PCR扩增及测序结果完全相符。采用Cycleave 应用于临床标本检测：136份痰液标本中，12份出现与阳性对照pMD-2063相同的扩增结果，其它124份均为阴性结果，也与常规PCR扩增及测序结果完全相符。