C-型凝集素在棉铃虫抗细菌感染的血细胞免疫激活中的作用机理

The innate immune system is very important for resisting pathogen invasions in insects. C-type lectin is an important pattern recognition receptor in the insect innate immune system. Previous studies has proved that C-type lectin is involved in the activation of a variety of haemocyte-mediated immune responses. However, the detailed mechanism is largely unknown. Our work indicated that a C-type lectin of Helicoverpa armigera (Ha-CTL) could function as a pattern recognition receptor in vivo to promote the haemocyte phagocytosis of pathogens and protect the insect from bacterial infection. In this proposal, we would like to perform funtional study on a new C-type lectin (Ha-CTL2). The expression patterns of Ha-CTL2 will be analysis by real-time PCR and in situ hybridization. The bacteria binding activity of Ha-CTL2 will be determined by in vitro study. The in vivo function of Ha-CTL2 will be verified by RNAi experiments. The immune cofactors of HaCTL2 will further be screened and identified from gene and protein levels by RNAi, real-time PCR, Pull-down and other methods. Ultimately, this study could clarify the function and mechanism of C-type lectin in haemocyte-mediated immune responses activation of Helicoverpa armigera. It not only lays the foundation for better understanding of the molecular mechanism of the insect innate immune, but also helps to find the new available targets and further provides new way for insect pest control.

先天免疫在昆虫抵抗病原菌入侵的过程中有非常重要的作用。C-型凝集素是昆虫先天免疫系统中重要的模式识别受体。现有研究已证明C-型凝集素参与了多种血细胞先天免疫反应的激活，然而其具体的作用机制尚待进一步的研究。申请者已证明一种棉铃虫C-型凝集素能够通过促进血细胞的吞噬作用增强棉铃虫抗细菌感染的能力。在此基础上本项目将对一种新的棉铃虫C-型凝集素（Ha-CTL2）进行深入研究。通过实时定量PCR和原位杂交，研究Ha-CTL2的表达模式；通过测定体外活力，研究Ha-CTL2可以识别的细菌类型；通过RNAi，验证Ha-CTL2的体内功能；通过Pull-down等实验，从基因和蛋白水平筛选和鉴定HaCTL2功能相关免疫因子。本研究将阐明C-型凝集素在棉铃虫血细胞免疫激活中的功能及作用机理。不仅为进一步了解昆虫先天免疫的分子机理奠定基础，而且在此基础上可以从中发现可资利用的新靶标，为害虫防治提供新思路。

由于昆虫缺乏获得性免疫，先天免疫在昆虫抵抗病原菌入侵的过程中有非常重要的作用。C-型凝集素是昆虫先天免疫系统中重要的模式识别受体。现有研究已证明C-型凝集素参与了多种血细胞先天免疫反应的激活，然而其具体的作用机制尚待进一步的研究。在本项目中我们综合利用分子生物学、生物化学和细胞生物学技术对棉铃虫的C-型凝集素（HaCTLs）进行深入研究。基于前人的研究，我们从棉铃虫中克隆得到了8条C-型凝集素（HaCTL1- HaCTL8）的全长序列。利用实时定量PCR测定了8个HaCTLs在不同细菌刺激后的表达模式，结果显示不同的HaCTLs在不同细菌刺激后具有不同的表达变化，暗示它们可能在抵抗不同细菌感染时发挥作用。对HaCTL2进行了原核重组表达和体外功能研究，证明它具有Ca2+依赖的血细胞凝集活性并具有比较广泛的细菌识别和结合能力。采用dsRNA注射法分别对HaCTL2、HaCTL3、HaCTL5和HaCTL7进行了RNAi，发现干扰后棉铃虫在受细菌感染后的死亡率都明显上升。而干扰HaCTL2后的棉铃虫血细胞吞噬活力和血淋巴黑化活力明显降低。采用实时定量PCR的方法检测干扰HaCTL2后免疫相关基因的表达变化，结果显示实验组中黑化反应相关基因的表达水平明显低于对照组。进一步采用pull-down的方法检测到了酚氧化酶原、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制因子等黑化相关蛋白与HaCTL2有互作。证明HaCTL2主要在棉铃虫抵抗细菌感染后的黑化反应激活中发挥重要作用。此外，通过本项目我们还对亚洲玉米螟进行了转录组测序并鉴定获得到了大量先天免疫相关基因，并进一步对其中的C-型凝集素及互作基因进行了研究。最终，本研究初步阐明C-型凝集素在棉铃虫血细胞免疫激活中的功能及作用机理。为进一步了解鳞翅目昆虫先天免疫的分子机理奠定基础，而且在此基础上可以从中发现新的可资利用的靶标，为害虫防治提供新思路。