哺乳动物体细胞克隆胚胎抗氧化机理的研究

ROS( reactive oxygen species, ROS ) is a general term for a series of active organism oxygen containing compounds.In the oocyte, embryo metabolism and / or growth environment are likely to produce ROS.In the somatic cell cloned embryo production process, excessive ROS condition in vitro can causes oxidative metabolites increased in cells, the antioxidant protection mechanism is insufficient in cell itself, cause ROS accumulation and toxic to cells, leading to development block of embryo in vitro, especially in the early stages of embryonic gene regulation by the mother to zygotic transition ( maternal embryonic transition, MET ) is more obvious. 　　　In this program, SCNT embryos are served as research materials, and TRC is the marker of zygotic gene activation (ZGA)or MET , the mRNA and protein changes of antioxidative enzyme at the time of MET will be tested,and the fluctuation of cellular ROS will be checked out, the effects of ROS on the phase of MET and proliferative regularity of peroxisome in early embryos are also determined , those experimentscan illustrate the antioxidative mechanism of oocytes and early embryos in mammalian animals,the effect of nuclear transfer manipulation on the antioxidative ability of embryos and base the fundation of suprior embryos production system.

活性氧是生物体内的一系列活性含氧化合物的总称。在卵母细胞、胚胎的代谢和/或生长环境中都有可能产生ROS。体细胞克隆胚胎生产过程中，体外环境下过量的ROS会导致细胞内的氧化代谢物增加，使得细胞自身抗氧化保护机制不足，引起ROS堆积并对细胞产生毒性，导致胚胎体外发育阻滞，尤其在早期胚胎基因调控由母型向合子型过渡阶段更为明显。本项目以哺乳动物体外成熟的卵母细胞为研究对象，研究卵母细胞成熟过程中抗氧化酶mRNA水平的变化和过氧化物酶体的增殖规律；以哺乳动物体细胞克隆胚胎为研究对象，将TRC作为合子基因组激活的标记物，研究MET前后抗氧化酶mRNA水平和活性变化、细胞内源性活性氧的波动，探讨活性氧对MET阶段的影响以及体细胞克隆胚胎发育中过氧化物酶体的增殖规律，阐明哺乳动物卵母细胞和体细胞克隆胚胎的抗氧化机理，同时探索核移植过程对胚胎抗氧化能力的影响。

活性氧是生物体内的一系列活性含氧化合物的总称。体细胞克隆（SCNT）胚胎生产过程中过量的ROS会对细胞产生毒性，尤其在母型向合子型过渡阶段更为明显。项目研究内容为，抗氧化剂对哺乳动物卵母细胞体外成熟以及SCNT胚胎体外发育的影响、体内外胚胎与SCNT胚胎的 MET时期内源性ROS含量变化以及抗氧化酶表达的研究、ROS对早期胚胎过氧化物酶体以及抗氧化酶表达的影响、ROS介导早期胚胎未折叠蛋白质反应通路的研究、吡格列酮对母型-合子型过渡时期哺乳动物胚胎抗氧化能力的影响、ROS诱导P53信号通路对胚胎体外发育的影响、紫檀芪和Salubrinal对哺乳动物早期胚胎抗氧化机理的研究、哺乳动物早期胚胎内部ROS水平与胚胎凋亡通路关系的研究。研究结论如下：①抗氧化剂对哺乳动物卵母细胞体外成熟以及SCNT胚胎体外发育均有明显效果。②不同抗氧化酶基因表达在鼠早期胚胎发育的不同时期有所不同；鼠胚胎4-细胞期过氧化物酶体膜蛋白70含量最高，8-细胞期过氧化物酶体含量最低。③延边黄牛SCNT胚胎编码CAT、Mn-SOD和GPx的mRNA随着染色体基因组的激活而表达，大量表达的时期晚于胚胎内部ROS大量产生的时期。④GSH可以通过缓解内质网应激（ERS）从而改善小鼠胚胎的发育潜能。⑤吡格列酮可降低氧化损伤小鼠胚胎内ROS水平，促进氧化损伤胚胎发育; 通过诱导PPARy表达，激活NRF2抗氧化通道，从而诱导胚胎内抗氧化酶表达; 可抑制氧化损伤小鼠胚胎内部NADPH氧化酶活性。⑥ROS应激诱导P53表达,并刺激GADD45a、P21的表达来降低细胞周期相关基因cdc2、CDK4的表达, 导致细胞发生阻滞现象。⑦紫檀芪（PTS）通过Keap1-Nrf2信号通路改变涉及到抗氧化和抗凋亡的下游基因的表达来影响胚胎发育。通过PTS的处理减少ERS从而显著增加小鼠胚胎的发育潜力。⑧Salubrinal可以通过PERK通路减弱ER应激，从而提高小鼠胚胎的发育潜力。⑨Caspase-12参与活性氧引起的内质网通路应激过程。通过揭示哺乳动物早期胚胎和SCNT胚胎抗氧化机理，为提高SCNT胚胎生产效率提供了一定的理论依据，为开发胚胎体外培养和SCNT胚胎生产新技术奠定了基础。