利用斑马鱼模型研究瓣膜高表达基因kbtbd1在心脏瓣膜结构发育中的功能

The applicant has found that kbtbd1 gene is specifically highly expressed in the heart valve during early embryogenesis in zebrafish by in situ hybridization analysis, which indicated that this gene may involve in the development of heart valves. The applicant also discovered that kbtbd1 knockout zebrafish homozygotes showed valvular defects. Mass spectrometry and CO-IP analysis demonstrated that KBTBD1 interacted with NOMO, and they inhibited the valve development Cited2-Nodal-Pitx2c signaling. As previous findings proved that NOMO is the direct target gene of Nodal, the applicant hypothesized that KBTBD1 is a novel key regulatory gene in valve development that regulating valve development via Cited2-Nodal-Pitx2c signaling. However, the report about this gene in regulating valve development is currently vacant. The applicant intends to utilize kbtbd1 knockout and transgenic zebrafish models and investigate the function of KBTBD1 gene in regulating the development of heart valves. Uncover that how KBTBD1 interacts with NOMO and inhibits the valve development. And study whether KBTBD1 regulates the development of heart valves via Cited2-Nodal-Pitx2c signaling. This study is of great significance in revealing the occurrence mechanism of KBTBD1 gene related valve disease in human.

申请者前期研究发现：kbtbd1基因在斑马鱼早期胚胎发育的心脏瓣膜结构部位特异高表达，提示该基因与瓣膜结构的发育有关；通过斑马鱼模型证明：kbtbd1基因敲除纯合子致死，出现瓣膜发育缺陷；CO-IP等实验表明：KBTBD1与NOMO是互作蛋白。国际同行证明Nodal是NOMO的直接靶基因，形成的Cited2-Nodal-Pitx2c信号调控瓣膜的发育。申请人又证明，KBTBD1与NOMO拮抗调控该信号途径。故据此假设：KBTBD1是通过Cited2-Nodal-Pitx2c信号控制瓣膜发育的一个新的关键基因；但国内外尚无相关研究报道。申请者拟通过kbtbd1基因敲除和转基因斑马鱼模型，研究该基因调控心脏瓣膜结构发育的生物学功能；及其如何与NOMO拮抗，通过Cited2-Nodal-Pitx2c信号调控瓣膜的发育。该研究对揭示KBTBD1基因在人类心脏瓣膜疾病发生中的分子机制具有重要意义。

前期研究表明，kbtbd1基因在心脏瓣膜部位特异性高强度表达，提示其功能可能与心脏瓣膜的发育有关。进一步体外实验证明，Kbtbd1与Nomo蛋白相互作用。在此基础上，本项目系统分析了kbtbd1在斑马鱼模型中的时空表达模式。结果表明，在胚胎发育到14体节期，kbtbd1在心脏原基左侧的表达高于右侧；到16体节期，kbtbd1的表达则在心脏原基的右侧高于左侧；18体节期后，kbtbd1在心脏两侧的表达水平趋于一致。.利用kbtbd1敲除品系进行表型分析表明，kbtbd1纯合子胚胎出现围心腔肿大、心脏不能正常环化的表型；该心脏环化异常可能与早期心脏前体细胞的迁移缺陷有关。原位杂交分析结果显示，kbtbd1基因敲除纯合子胚胎中的Versican和Has2的表达上调；而Tbx2b，Notch1b和 BMP4的表达不变，这些试验结果强烈提示kbtbd1基因的功能与瓣膜发育相关。利用kbtbd1敲除品系进行心脏转录组测序分析表明，敲除kbtbd1 可以导致TGF-β/Nodal信号通路中的重要成员Pitx2和Bmp2a等基因的表达显著下调；原位杂交分析结果发现，kbtbd1激活pitx2的表达;敲除或敲减kbtbd1基因导致pitx2的表达下调；反之，过表达pitx2基因则可以拯救kbtbd1基因敲除突变导致的瓣膜发育异常的表型。这些结果初步验证了kbtbd1基因通过Nodal- Kbtbd1-Pitx2信号调控心脏和瓣膜的发育。.基于与Kbtbd1相互作用的Nomo蛋白是一个Nodal的拮抗因子，敲减年nomo基因导致kbtbd1在心脏原基两侧的表达增强；反之，过表达nomo基因导致kbtbd1的表达下调。但敲除nomo基因本身没有导致明显的心脏表型异常。kbtbd1基因的敲除不影响BMP4的表达；反过来，BMP4则可以抑制kbtbd1在右侧心脏原基中的表达。据此推断，kbtbd1可能是位于背中线右侧的BMP4-Prrx1a信号的一个新的成员，在背中线右侧通过BMP4-kbtbd1-Prrx1a信号轴调控心脏发育。.综上所述，该研究结果初步揭示了kbtbd1基因在心脏细胞迁移、环化以及瓣膜发育中的功能和潜在作用机制。